Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Fabricação dos eletrodos de estimulação
- Para fazer um eletrodo de estimulação, corte seis pedaços de 10 cm de comprimento de fios de conexão em miniatura, remova 2 cm do revestimento em uma extremidade e 1 cm na outra extremidade.
- Torça dois cabos juntos e solde-os no lado descascado mais curto.
- Adquira uma tira de embalagem de três fitas de qualquer circuito integrado com a caixa SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Costure os fios trançados nos três orifícios da embalagem. O segmento descascado mais longo dos fios deve estar nas cavidades da embalagem. Posicione os cabos de forma que a extremidade do isolamento fique alinhada com a borda dos orifícios.
- Coloque o cimento dental nos furos para fixar os fios.
cuidado: O cimento dentário deve ser denso o suficiente para evitar vazamento na cavidade da embalagem.
- Assim que o cimento estiver solidificado (mínimo 10 min), vire a embalagem e coloque uma fina camada de supercola no orifício para formar uma vedação estanque em direção ao cimento poroso. Evite colar os fios descascados.
- Torça os cabos juntos no lado descascado mais curto e solde-os (Figura 1A).
- Pegue o segmento descascado mais longo dos fios com a ponta de uma pinça fina, enrole-os e enrole-os nas cavidades (Figura 1B). Se necessário, corte o excesso de cabo.
2. Fabricação dos eletrodos de gravação
- Para fazer um eletrodo tripleto de gravação (Figura 1C-D), corte um pedaço de tubo de aço inoxidável de um centímetro de comprimento usando uma serra rotativa de alta velocidade. Remova a aleta das extremidades do tubo com uma agulha afiada e certifique-se de que o tubo esteja limpo de detritos e completamente permeável.
nota: Não use alicates, pois eles distorcerão o tubo.
- Dobre um pino espaçador de placa banhado a ouro com um comprimento mínimo de 3 cm para formar um suporte em forma de J. Corte a perna mais longa da forma de 'J' e solde-a para obter de volta a forma original para fazer uma junta destacável entre a parte linear longa, que será mantida pelo dispositivo estereotáxico, e a forma de 'U', que segurará o eletrodo e servirá como ponto de ancoragem. Cole o tubo e a perna mais curta do suporte 'J' juntos. Cole algumas barras adicionais de 1 cm de comprimento, se necessário, para estabilidade.
- Corte 3 pedaços de fios de eletrodo de 2,5 cm de comprimento com uma tesoura ultrafina de aço inoxidável. Certifique-se de que o corte seja claro e nítido e que o isolamento esteja intacto na superfície circular do fio do eletrodo. Além disso, certifique-se de que a ponta cortada não esteja dobrada devido à força aplicada. Dobre 1 ou 2 mm em uma extremidade de cada um dos fios em ângulos diferentes (por exemplo, um reto esquerdo, um de 45° e um ângulo reto) para torná-los distinguíveis.
- Encha o tubo com os fios. Escolha um espaçamento apropriado dos eletrodos para o experimento (por exemplo, para registro de potencial de campo local cortical (LFP) e densidade de fonte de corrente (CSD), a protrusão recomendada das pontas dos fios da abertura do tubo é de 4.5 mm, 4.1 mm e 3.7 mm, respectivamente). Observe qual fio corresponde a qual profundidade para manter uma ordem de canal adequada.
- Uma vez que os fios se alinham um ao lado do outro e estão paralelos ao tubo, para fixar os fios do eletrodo, coloque uma única gota de supercola líquida em ambas as extremidades do tubo com uma agulha afiada. Certifique-se de que a cola esteja fluindo para dentro do tubo devido ao efeito capilar, mas não em direção aos locais de gravação nas extremidades salientes.
- Prepare uma placa de interface de eletrodo com um microconector adequado compatível com o sistema de registro a ser usado.
- Introduza as extremidades dobradas e sem gravação dos fios nos orifícios da placa de interface do eletrodo correspondentes ao canal de gravação desejado. Quando todos os fios estiverem na posição, empurre os pinos dourados nos orifícios com uma pinça.
nota: Os pinos de ouro podem ser fixados no lugar usando cimento dental, mas na maioria dos casos, eles são estáveis o suficiente sem essa etapa de segurança.
3. Anestesia
- Coloque o animal em uma câmara de indução de anestesia selada e encha-a com 4 a 5% de isoflurano em 2 L/min de ar medicinal.
- Quando o rato estiver deitado, retire o animal da câmara e coloque-o em uma estrutura estereotáxica com um revólver de ventilação apropriado.
- Defina o nível de isoflurano para 2%, embora a taxa de fluxo de ar deva permanecer a mesma. Verifique o nível de anestesia. Se houver ausência do reflexo de retirada da pata em resposta ao beliscão, continue, caso contrário, aumente a profundidade da anestesia.
- Monitore e mantenha a temperatura corporal do rato em 37 ± 0,5 °C com um sistema de monitoramento homeotérmico. Aplique uma gota de pomada de parafina nos olhos para evitar a dessecação da córnea. Repita este procedimento várias vezes durante a cirurgia, se necessário.
- Injete 0,3 mg/kg de atropina por via subcutânea para evitar a formação de muco nas vias aéreas. Para cirurgias mais longas, repita isso a cada quatro horas. Monitore a respiração e ajuste o vaporizador, se necessário.
4. Implantação dos eletrodos de estimulação e registro
NOTA: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos necessários e siga cuidadosamente as regras gerais de assepsia e antissepsia durante todo o procedimento. Evite tocar em áreas não estéreis fora da área cirúrgica. Mergulhe os eletrodos em álcool etílico (70%) por 30 min antes do implante.
- Remova a maior parte do cabelo do couro cabeludo com uma máquina de cortar cabelo. Aplique o creme depilatório no couro cabeludo, espalhe uniformemente na superfície e aguarde alguns minutos. Use uma espátula para remover suavemente o creme e o cabelo restante. Enxágue a pele com água e depois com desinfetante.
- Injete 1 - 2% de lidocaína (não exceda uma dose total de 7 mg / kg) por via subcutânea para anestesiar a pele. Aplique uma única gota de pomada veterinária para os olhos (por exemplo, parafina).
- Faça uma incisão sagital completa e longa (~ 2 cm) na linha média com um bisturi da testa ao pescoço. Disseque os tecidos, incluindo o periósteo, do crânio. Em seguida, usando um cinzel ou pinça de dente, limpe a área entre as cristas dos dois ossos temporais. Retraia a pele dissecada usando quatro buldogues para manter o crânio exposto.
- Coloque delicadamente uma pinça fina entre a borda íngreme do osso temporal e os músculos e separe-os. Faça movimentos de jigging para expor o máximo possível da grande superfície do osso temporal, de preferência da borda do osso occipital até o plano das suturas coronais, sem danificar os músculos.
- Coloque os afastadores bitemporalmente para manter os ossos temporais expostos.
- Enxágue a superfície do crânio com 1 - 2 mL de peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2) e lave-o com 1 - 2 mL de água.
- Seque ao ar a superfície dos ossos temporais com muito cuidado, limpando a umidade com bastões oculares. Teste se os eletrodos de estimulação se encaixam na superfície vertical limpa do crânio (a borda superior do eletrodo de estimulação deve estar alinhada com a borda da crista do osso temporal). Se necessário, reajuste os buldogues e os afastadores ou modele os eletrodos de estimulação com uma tesoura.
- Preencha as cavidades dos eletrodos de estimulação com gel eletrocondutor e coloque uma fina camada de cola na borda dos eletrodos.
- Coloque o eletrodo de estimulação na superfície seca do osso temporal com um movimento preciso e segure-o firmemente no lugar por um minuto com uma pinça fina. Certifique-se de que nenhuma umidade esteja em contato com a cola. Limpe com bastões oculares, se necessário.
cuidado: Se o eletrodo ficar instável, remova-o. Depois de limpar o osso, repita esta etapa com um novo eletrodo de estimulação.
- Coloque cimento dental sobre as bordas do eletrodo de estimulação, secando continuamente a umidade vazada nos tecidos com bastões oculares. Em seguida, cubra todo o eletrodo de estimulação com cimento.
- Depois que o cimento estiver completamente endurecido, repita essas etapas no lado contralateral.
- Faça alguns furos em todo o crânio para ancorar os parafusos. Insira parafusos em miniatura nos orifícios e coloque cimento dental sobre eles. Use uma cabeça de broca de diâmetro ~10% menor em comparação com o diâmetro do parafuso.
- Dependendo do objetivo dos experimentos, solde um conector nas extremidades dos cabos, coloque-o na superfície e cubra-o com cimento, ou continue implantando os eletrodos de gravação e fibras ópticas, ou prepare uma janela craniana sobre o crânio. Neste último caso, solde os conectores e prenda-os à construção apenas no final. Em caso de necessidade de registros simultâneos de TES e LFP de longo prazo, implante os trigêmeos de eletrodos acima mencionados em vez de fios simples.
nota: Essa configuração permite a remoção de artefatos de estimulação de modo comum8. Para obter detalhes sobre o registro do implante do eletrodo, consulte os protocolos anteriores.
- Lave abundantemente os tecidos expostos com desinfetante. Injete 1 a 2% de lidocaína por via subcutânea (não exceda a dose total de 7 mg / kg).
- Desbride as bordas da ferida e feche-as com suturas simples interrompidas ao redor do conector/implante. Em seguida, desinfete a ferida com iodopovidona.
- Injetar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea. Repita isso se necessário.
nota: Quaisquer outros analgésicos podem ser usados, atendendo aos requisitos estabelecidos pelo conselho de permissão ética local.
- Suspenda a anestesia, solte as barras auriculares e o revólver e coloque o animal em uma gaiola de recuperação pós-operatória para recuperar a consciência.
- Certifique-se de que o animal esteja sob supervisão rigorosa durante as primeiras horas de pós-operatório. Continue monitorando a área do implante periodicamente.
nota: O animal não deve ser deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Aloje o animal individualmente até que ele se recupere totalmente do procedimento.
