Registrando correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila

Resumo

Fonte: Vasin, A., et al. Gravações focais de macropatch de correntes sinápticas da junção neuromuscular larval de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a técnica para registrar correntes sinápticas de um botão sináptico na junção neuromuscular da larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único botão sináptico, o que é importante para o estudo de linhas de mosca mutantes com atividade sináptica espontânea ou assíncrona aumentada.

Protocolo

1. Fabricação de eletrodos de gravação

1. Puxando os eletrodos de vidro
   1. Use o seguinte protocolo para o extrator de microeletrodos (consulte a Tabela de Materiais):
      1. Linha 1: Calor 510 Pull - Velocidade 30 Vezes 250; Linha 2: Calor 490 Pull - Velocidade 30 Tempo 250.
         nota: As unidades de tempo correspondem a 0,5 ms por unidade; as outras unidades são relativas. O valor do calor deve ser ajustado para cada filamento após a realização do teste de rampa.
   2. Use um microscópio (ampliação de 35x) para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado esteja na faixa de 7 a 10 μm (Figura 1A). Armazene os capilares em recipientes bem fechados para evitar o acúmulo de poeira.
2. Polimento a fogo
   1. Polimento de fogo capilares (80 - 90% do valor máximo de calor por 1 - 2 s) usando uma microforja (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que o diâmetro interno final do eletrodo polido seja de 5 μm (Figura 1A).
3. Dobra
   NOTA: Duas curvas são feitas para posicionar o eletrodo na parte superior do músculo sob uma objetiva de alta ampliação.
   1. Use o aparelho mostrado na Figura 1B. Fixe o eletrodo no manipulador e posicione a ponta sobre o filamento, sem tocá-lo.
   2. Defina o valor de calor para 60 - 70% do máximo e pressione o pedal da micro-forja por 1 - 2 s (consulte a Tabela de Materiais) para aquecer o filamento. Use uma agulha em forma de L para puxar suavemente a ponta do eletrodo para baixo (Figura 1B ampliada). Faça a curva a aproximadamente 90o (Figura 1C).
   3. Segure o eletrodo sobre a chama da tocha com a mão usando uma pinça e faça a segunda curva a uma distância de 7 a 10 mm da primeira curva e em um ângulo de aproximadamente 120^o (Figura 1C).

2. Etapas preparatórias adicionais

1. Preparar solução semelhante à hemolinfa (HL3) (em mM): 70 cloreto de sódio (NaCl), 5 cloreto de potássio (KCl), 20 cloreto de magnésio (MgCl₂), 10 hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO₃), 5 trealose, 115 sacarose, 5 ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico (HEPES) e cloreto de cálcio 1 mM (CaCl₂); ajustar o pH para 7,3-7,4. Mantenha a solução na geladeira e faça-a fresca todas as semanas.
2. Faça as pipetas de estimulação da mesma forma que grava as pipetas de vidro, exceto que não há necessidade de dobrá-las.
   nota: A preparação dos eletrodos de estimulação é descrita em detalhes em 28 e 27. O diâmetro final após o polimento a fogo deve estar na faixa de 5 a 7 μm.
3. Insira uma pipeta de estimulação em um suporte de microeletrodo conectado a uma seringa.

3. Registros elétricos de correntes juncionais excitatórias (EJCs)

1. gravação
   1. Coloque a placa de Petri com a preparação no microscópio stage (Figura 2). Insira o eletrodo de referência no banho.
   2. Encha o eletrodo de registro com solução HL3. Sob a objetiva 10x (ver Tabela de Materiais), mergulhe o eletrodo no banho e coloque-o sobre os músculos 6 e 7 dos segmentos abdominais 2, 3 ou 4 usando o micromanipulador (ver Tabela de Materiais) (Figura 3 A.1 e A.2).
   3. Mude a objetiva para 60x (consulte a Tabela de Materiais). Concentre-se na área de interesse usando epifluorescência ou óptica DIC. Coloque a ponta do eletrodo no topo do botão sináptico (Figura 3 B.1-3).
   4. Pressione o eletrodo muito suavemente no músculo. A pressão excessiva pode danificar a junção neuromuscular (JNM) ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea. Certifique-se de que a ponta do eletrodo não esteja entupida - se estiver, substitua-a.
   5. Ligue o amplificador, a placa A/D e o computador.
   6. Escolha o voltage clamp modo no amplificador.
   7. Inicie o software de aquisição e escolha o modo 'sem lacunas'.
   8. Observe o aparecimento de correntes juncionais excitatórias em miniatura (mEJCs) na tela do computador.
   9. Certifique-se de que a amplitude dos mEJCs esteja na faixa de 0,2 - 0,7 nA.
      nota: EJCs menores indicam que o eletrodo de registro tem defeitos ou que não está posicionado corretamente.
2. estimulação
   1. Usando um micromanipulador, sob controle visual, coloque o eletrodo de estimulação próximo ao axônio que inerva os segmentos abdominais 2 - 4.
   2. Aplique pressão negativa puxando o pistão da seringa conectada ao porta-eletrodo para que o axônio seja puxado para dentro do eletrodo (Figura 2).
   3. Ligue o estimulador. Gire o botão na unidade de isolamento (consulte a Tabela de Materiais) para definir uma corrente zero e, em seguida, aumente-a suavemente até que os EJCs apareçam (ou até que o limite seja atingido).
   4. Realizar a estimulação em regime supraliminar, com a corrente de estimulação aumentada aproximadamente duas vezes, em relação ao limiar para observação de EJCs.
      nota: Em nossa experiência, essa intensidade de estimulação é ideal para evitar falhas no potencial de ação e disparo do potencial de ação. Por exemplo, se os EJCs aparecerem na corrente de estimulação de 0,2 mA, use uma corrente de 0,4 mA durante todo o experimento.

Resultados

Figura 1. Etapas finais da fabricação da micropipeta. (A) Pontas do eletrodo após puxar e polir com fogo. (B.1) A configuração para dobrar a ponta. (B.2) A área encaixotada é mostrada ampliada à direita. O eletrodo e o filamento são fixados de forma que a ponta do eletrodo fique posicionada ligeiramente acima do fio e não se toque. (C.1

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microtocha 1WG61	Granulador	1WG61	Microtocha
Olympus BX61WI	Olimpo	BX61WI	Microscópio vertical
Olympus Lumplan FL N 60x	Olimpo	UPLFLN 60X	Objetiva para microscópio 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Olimpo	Uplanfl N 10X	Objetiva para microscópio 10X
Micromanipulador Narishige	Narishige	MHW-3	Micromanipulador hidráulico de água de três eixos
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	Amplificador eletrofisiológico
Mestre AMPI 8	A.M.P.I.	Mestre 8	Estimulador elétrico
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex	Isolador de estímulo
Mesa antivibração TMC	TMC	Telefone: 63-9090	Mesa antivibração
Gaiola de Faraday TMC	TMC	81-333-90	Gaiola de Faraday
Digidata 1322A	Axônio Instrumentos	Digidata 1322A	Digidata
computador	vale	Dell Dimension 5150	Computador com sistema operacional Win XP
Suporte de eletrodo	WPI	MEH3SW	Suporte de eletrodo
Filtro óptico	Óptica ômega	XF 115-2	Cubo de filtro para detecção de proteína fluorescente verde (GFP)
GRAMPO 8	Axônio Instrumentos	8.0.0.81	Software para gravação de sinal
Quantan	Software interno	-	Software para processamento de sinais
Cantão-S (tipo selvagem)	Centro de Estoque de Bloomington	Nº 64349	Linha de controle de mosca
cpx SH1	Presente generoso de J.T. Littleton	-	Linha de mosca knock-out de complexina com aumento da exocitose espontânea
CD8-GFP	Centro de Estoque de Bloomington	Rolamento 5137	Linha de mosca com etiqueta fluorescente neuronal (GFP)