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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Configuração do sistema
- Construa a unidade de controle de pressão.
- Monte a unidade de controle de pressão de acordo com o mapa do circuito (Figura 1). Solde as peças necessárias na placa de circuito impresso (PCB) fabricada de acordo com os esquemas do circuito elétrico (Figura 1b). Use resistores padrão, LEDs (diodos emissores de luz), transistores de efeito de campo de semicondutores de óxido metálico (MOSFETs), capacitores e conectores. Solde as válvulas solenóides no PCB (placa de circuito impresso). Conecte a bomba de ar e o sensor de pressão de ar à placa de circuito impresso com um fio elétrico.
NOTA: Depois que todas as peças necessárias estiverem disponíveis, a unidade de controle de pressão deve ser construída em cerca de 2 horas.
- Conecte a placa de aquisição de dados secundários (DAQ).
- Conecte as saídas de dados da placa de circuito impresso à placa DAQ, seguindo a Tabela 1.
nota: A placa DAQ será executada no "modo de terminação única". O mapa de portas está no manual do usuário (consulte a Tabela de Materiais).
- Conecte "AIn Pr S" a um dos canais de entrada analógica (AI) e "R-Gr" a um dos aterramentos analógicos na placa DAQ secundária.
- Conecte a saída primária do amplifier a um dos canais AI e o terra ao aterramento analógico da placa DAQ secundária.
NOTA: Um cabo BNC padrão pode ser usado para conectar a saída primária do amplificador.
- Descasque a outra extremidade e conecte o sinal positivo (ou seja, núcleo de cobre) ao canal AI e o terra (ou seja, o fio fino ao redor do núcleo) ao aterramento analógico. Repita essa etapa para um segundo canal se mais de um canal de patch for usado.
NOTA: A entrada analógica para a placa DAQ será configurada em etapas posteriores.
- Conecte a alimentação à saída de energia da placa DAQ secundária. Use uma fonte de alimentação separada de 12 V para a bomba.
- Conecte a tubulação.
- Conecte a bomba de ar e as duas válvulas.
- Na última etapa, use um conector de 3 vias para conectar o tubo macio da porta superior da válvula 2 ao sensor de pressão e ao porta-pipeta.
- Se duas pipetas forem usadas, adicione outro conector de 3 vias à tubulação conectada ao porta-pipetas. Ao corrigir, alterne manualmente entre as válvulas e as pipetas em uso.
- Instalar o Autopatcher IG.
NOTA: Requisito do sistema: O Autopatcher IG foi testado apenas em um PC com Windows 7. Ele não foi validado para outros sistemas operacionais. O procedimento descrito se aplica especificamente ao hardware listado na Tabela de Materiais.
- Baixe o Autopatcher-IG do GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- Instale o Python (consulte a Tabela de Materiais para obter a versão e o endereço de download).
- Desinstale a biblioteca PyQt4 digitando "pip uninstall PyQt4" em um terminal de linha de comando.
nota: O sistema usa uma versão mais antiga da biblioteca PyQt4 para obter compatibilidade com as bibliotecas Qwt e Opencv.
- Instale bibliotecas Python a partir de arquivos históricos de roda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encontre os seguintes arquivos: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Para instalar os arquivos wheel, vá para o diretório onde os arquivos são salvos e digite "pip install ***wheelfilename***.whl". Substitua "***wheelfilename***" pelo nome real do arquivo.
NOTA: "cp27" no nome do arquivo wheel indica Python 2.7 e "win32" indica Windows 32 bits. Se "win32" não funcionar, tente "win64".
- Para controlar a câmera CCD (dispositivo de carga acoplada), baixe e instale o instalador para 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Em seguida, baixe o MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar a câmera em Python.
- Para controlar os manipuladores e a platina do microscópio, instale o software de controle fornecido pelo fabricante.
nota: Ao fazer isso, o driver necessário para controlar os manipuladores também é instalado. O pacote de instalação é comumente fornecido em um CD-ROM.
- Para controlar a placa DAQ secundária, instale a Universal Library a partir do CD-ROM, fornecida com a compra da placa DAQ.
- Configure o hardware para o Autopatcher IG.
- Conecte a platina do microscópio e os controladores do manipulador ao computador por meio de portas USB.
- Atribua números de porta COM à unidade 0: platina do microscópio, unidade 1: manipulador esquerdo e unidade 2: manipulador direito, nesta ordem, no arquivo de configuração "ports.csv" na pasta "configuração". Deixe os outros parâmetros no arquivo ports.csv (ou seja, "SCI" e "1") inalterados.
nota: As informações do número da porta COM podem ser encontradas executando o software de configuração do manipulador fornecido pelo fabricante. Vá para a guia "configurações", selecione "configurações" e a página "Movimento" e leia os rótulos de cada guia na parte superior. Como alternativa, essas informações podem ser encontradas no Gerenciador de dispositivos do PC.
- Atribua números de canal de entrada analógica na placa DAQ para um sensor de pressão e patch canal 1 e 2 (correspondente às unidades 1 e 2). Digite o número do canal no arquivo "DAQchannels.csv" na pasta "configuração".
nota: Recomenda-se abrir os arquivos .csv com o aplicativo Bloco de Notas em vez de uma planilha, pois isso pode alterar as informações ao salvar as alterações.
- Execute o Autopatcher IG.
- Ligue o amplificador, o controlador do microscópio e o controlador do manipulador. Certifique-se de que o ampsoftware do amplificador está em execução.
- Execute o Autopatcher IG com Python a partir de um terminal de linha de comando da seguinte maneira: primeiro, altere o diretório (comando "cd" para os terminais mais comuns) onde o Autopatcher IG está instalado, digite "python Autopatcher_IG.pyw" no terminal de linha de comando e pressione a tecla "Enter".
NOTA: Não execute o software de controle do manipulador antes de executar o Autopatcher IG, pois ele ocupará a platina do microscópio e o manipulador, fazendo com que o Autopatcher IG não consiga encontrar o hardware. O software de controle do manipulador pode ser executado após o Autopatcher IG ser totalmente iniciado se houver módulos adicionais a serem controlados (por exemplo, o aquecedor em linha).
- Calibre a pipeta primária.
- Puxe pipetas de remendo. Encha uma pipeta de vidro puxado com uma solução interna e carregue-a no estágio principal.
NOTA: As pipetas de vidro vazias têm contrastes diferentes ao microscópio e podem levar a uma calibração imprecisa.
- Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a em foco. Se o teclado do mostrador for usado para mover os manipuladores e/ou a platina do microscópio, atualize as coordenadas pressionando "z" no teclado.
nota: Esta ação não é necessária se o teclado (platina do microscópio: A/D - eixo x, W/S - eixo y, R/F - eixo z; manipuladores: H/K - eixo x, U/J - eixo y, O/L - eixo z, 1/2 - número da unidade) for usado para controlar o movimento porque as coordenadas serão atualizadas em tempo real.
- Clique no botão "Iniciar calibração" na interface gráfica do usuário (GUI) principal da unidade correspondente na qual a pipeta está carregada (Figura 2).
nota: Uma janela pop-up aparecerá quando a calibração for concluída.
NOTA: A calibração será realizada automaticamente, o que levará cerca de 3.5 min. Clicar no mesmo botão (alternado agora para "cancelar calibração" após iniciar a calibração) abortará a tentativa de calibração.
- Salve a calibração clicando em "salvar calibração" na parte inferior da GUI principal (ela salva a calibração atual para ambos os manipuladores e pode ser carregada no futuro).
NOTA: O campo de view sob ampliação baixa (4 ou 10X) e alta (40X) deve ser alinhado para que a calibração secundária funcione corretamente. Consulte o manual do usuário do sistema óptico em uso para os procedimentos de alinhamento.
2. Procedimento Automático de Patch Clamp
- Prepare fatias cerebrais agudas
- Prepare pipetas de vidro para o patch clamp.
- Coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia com uma repressão de fatia ou "harpa".
- Detecte a célula fluorescente.
- Encontre a área de interesse sob a lente 4X. Mova a platina do microscópio ativando o modo clique para mover ("CTM") e clicando no centro da área de interesse. Como alternativa, use o teclado para mover a platina do microscópio (A/D - eixo x, W/S - eixo y, R/F - eixo z).
- Mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo z, usando R/F no teclado.
NOTA: Recomenda-se ajustar o nível do banho-maria para que o plano focal sob as lentes de baixa e alta ampliação seja igual ou semelhante no eixo z.
- Clique no botão "Detectar célula" na coluna principal da GUI, "Unidade 0". Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puder ser controlada pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED/laser; uma janela pop-up aparecerá quando a detecção da célula for concluída.
- Desligue o LED/laser, se necessário; uma lista de coordenadas da célula aparecerá na GUI "Posições da memória". Remova as células indesejadas da lista clicando no botão "X" ao lado das coordenadas.
- Como alternativa, se as células-alvo não estiverem marcadas com fluorescência, clique em "Modo mouse" na GUI principal. Clique na célula de interesse; um ponto amarelo com um número aparecerá na célula e as coordenadas da célula aparecerão na GUI "Posições da memória".
- Calibre a pipeta secundária.
- Encha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Carregue a pipeta no suporte da pipeta preso ao estágio principal.
- Use a lente de baixa ampliação. Traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado (H / K - eixo x, U / J - eixo y, O / L - eixo z). Use "1" e "2" para alternar entre a unidade 1 e a unidade 2.
- Carregue a calibração primária clicando em "Carregar calibração". Clique no botão "Calibração secundária" na GUI principal sob a unidade que está em uso. Por example, se a unidade 2 estiver em uso, clique no botão "Calibração secundária" na coluna "Unidade 2". Siga as instruções da janela pop-up para alternar para a lente de alta ampliação.
- Aplique patch em uma célula de destino.
- Certifique-se de que o software "MultiClamp" (ou seja, amplificador) está em execução. Clique no botão "Controle de patch" para abrir a GUI "Controle de patch"; pode levar alguns minutos para abrir esta GUI.
- Use a lente de ampliação de 40X marcando "40X" na coluna "Unidade 0" da GUI principal. Clique no botão "ir para" ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI "Posição da memória"; O microscópio se moverá para a célula.
- Clique no botão CTM da unidade em uso na GUI principal para habilitar o movimento após um clique do mouse. Clique na célula de interesse; A ponta da pipeta se moverá para a célula.
- Clique no botão "Patch" na GUI "Controle de patch".
nota: A correção automática começará e a pressão e a resistência podem ser monitoradas na GUI "Controle de patch".
- Use o botão "Unidade 1 selecionada" para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades.
NOTA: O sistema se aproximará da célula-alvo, aplicará pressão negativa, corresponderá ao potencial da membrana celular e detectará a formação de gigaseal com base em uma série de limiares e lógica de pressão e resistência.
- Manipule o processo automático a qualquer momento clicando nos respectivos botões na GUI "Controle de patch". Por exemplo, clique no botão "Patch" novamente para cancelar a avaliação do patch e clique em "Próxima etapa" para avançar o processo de correção para a próxima etapa, independentemente do limite.
NOTA: Uma janela pop-up notificará o usuário quando um gigaseal for formado, e a opção de aplicar zap junto com grande pressão negativa será apresentada.
- Selecione "Sim" para interromper com zap e sucção combinados. Como alternativa, selecione "Não" para interromper apenas com sucção.
NOTA: Quando um patch de célula inteira bem-sucedido for concluído, uma janela pop-up lembrará o usuário de salvar o log de patch do experimento.
- Salve o patch do experimento log.
NOTA: Se uma avaliação de patch não for bem-sucedida, uma janela pop-up notificará o usuário e o processo de patch será reiniciado.
- Volte para a etapa 2.4 e repita as etapas com uma célula diferente.