Registro eletrofisiológico de nervos aferentes colônicos em um cólon de rato ex vivo

Resumo

Fonte: Meng, Y. et al., Caracterização in vitro das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um método para registrar a atividade dos nervos aferentes do cólon em um cólon de rato ex-vivo, canulado em ambas as extremidades e infundido com solução salina para aumentar a pressão intraluminal. À medida que a pressão aumenta, o sinal nervoso aumenta, indicando sua estimulação.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação da solução de perfusão e dos compostos de ensaio

1. Prepare 5 L de solução de Krebs: cloreto de sódio 113 mM, NaCl, cloreto de potássio 5,9 mM, KCl, fosfato de sódio di-hidrogênio 1,2 mM, NaH₂PO₄, sulfato de magnésio 1,2 mM, MgSO₄, bicarbonato de sódio 25 mM, NaHCO₃, cloreto de cálcio 1,2 mM, CaCl₂ e glicose 11,5 mM. Saturar a solução com uma mistura gasosa de 95% de O₂ + 5% de CO₂. Pré-resfrie ~ 500 mL de Krebs oxigenados na geladeira.
2. Preparar alíquotas de compostos de ensaio (1 mM de capsaicina em etanol e 10 mM de 5-hidroxitriptamina (5-HT) em solução salina) conforme necessário. Diluir a massa em Krebs (para aplicação em banho) e em solução salina (para administração intraluminal) até à concentração final imediatamente antes da utilização.

2. Preparação do eletrodo de registro

1. Puxe o eletrodo de gravação de tubos de vidro padrão sem filamentos internos (diâmetro externo de 1.5 mm) usando um extrator de eletrodo convencional. Ajuste as configurações do extrator para calor e tração de modo que a haste dos eletrodos puxados fique entre 20 e 25 mm.

3. Coleta de tecidos

1. Anestesiar profundamente o rato com pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p.).
2. Ao mesmo tempo em que garante a esterilidade, exponha a cavidade abdominal realizando uma incisão na linha média da parede abdominal usando um bisturi. Puxe o mesentério e outros tecidos para o lado para expor o colorreto.
3. Coloque o animal sob o microscópio de dissecação. Por meio de uma dissecção cuidadosa, localize o gânglio pélvico esquerdo (PG) e identifique os nervos pélvicos (NP) e os nervos esplâncnicos lombares (LSN) que se juntam a ele. Corte esses nervos a alguns milímetros de distância do PG.
   nota: O PG fica próximo à junção colorretal. Tipicamente, 3 - 4 NP da medula espinhal lombossacral e um LSN projetam para o GP (Figura 1).
4. Corte o osso da sínfise para expor o reto. Remova os tecidos (ou seja, bexiga urinária, etc.) acima do colorreto; tenha cuidado para deixar o PG intacto.
5. Sacrifique o rato pela injeção intravenosa de uma overdose de pentobarbital. Passe o cólon cerca de 3 cm acima do PG e remova o colorreto do animal usando uma pinça.
6. Transfira o colorreto para uma placa de Petri cheia de solução de Krebs pré-resfriada. Remova as fezes lavando suavemente o cólon. Remova a bexiga urinária remanescente e outros tecidos com cuidado, sem comprometer o PG.

4. Dissecção dos nervos aferentes do cólon

1. Coloque o cólon em uma câmara de registro (20 mL) e perfunda o tecido continuamente com solução de Krebs carbogenada. Defina a taxa de perfusão em 15 mL / min.
2. Canule o colorreto nas extremidades oral e anal. Inicie a infusão intraluminal do cólon com solução salina a uma taxa de 10 mL / h na direção oral para anal.
3. Localize o PG principal sob o microscópio de dissecação. Use alfinetes de insetos para expor o gânglio. Com dissecção cuidadosa, encontre um ramo fino do nervo que emana do gânglio e corre em direção ao cólon (Figura 1). Corte o nervo próximo ao gânglio.
   NOTA: A Figura 1 ilustra o registro de um ramo nervoso distal ao GP. O nervo presumivelmente contém uma mistura de fibras aferentes esplâncnicas pélvicas e lombares. Alternativamente, um registro pode ser feito a partir do NP e/ou do LSN proximal ao GP.
4. Ligue o banho de aquecimento e aqueça a solução de Krebs para manter a temperatura da câmara em 34 ± 0,5 °C.

5. Preparação do eletrodo de sucção

1. Pegue uma pipeta de vidro pré-puxada (etapa 2) e inspecione-a sob o microscópio de dissecação. Quebre a ponta do eletrodo com uma pinça para que fique de tamanho compatível com o diâmetro do nervo a ser registrado.
2. Chanfre a ponta colocando-a perto de um alargamento mais leve.

6. Registro eletrofisiológico

1. Conecte o eletrodo chanfrado ao suporte do eletrodo. Conecte uma seringa de 10 mL à porta lateral do suporte para aplicar pressão negativa ou positiva ao eletrodo.
2. Conecte o suporte ao headstage do bioamplifier e monte o headstage em um manipulador.
3. Mova o eletrodo para o banho de tecido e encha o eletrodo com a solução de Krebs aplicando sucção suave até que ele entre em contato com o fio de prata do suporte. Coloque a ponta do eletrodo perto da extremidade cortada do nervo e aplique pressão negativa para sugar o nervo para dentro do eletrodo. Aplique mais pressão negativa para que ~ 1 mm do nervo seja puxado para dentro do eletrodo e forme uma vedação hermética.
4. Ligue o bioamplificador e ajuste o filtro para 300 - 3.000 Hz. Monitore o sinal no osciloscópio e registre o sinal nervoso (taxa de amostragem de 20 kHz) e o sinal de pressão intraluminal (taxa de amostragem de 100 Hz) usando um computador com software de processamento de dados de pico.

7. Testando a sensibilidade aferente do cólon

1. Aplique a distensão em rampa do cólon fechando a torneira de três vias na cânula de saída enquanto infunde continuamente intraluminalmente. Monitore a pressão intraluminal até atingir 60 mmHg, momento em que abra a torneira de três vias na cânula de drenagem.

Resultados

Figura 1. Registro eletrofisiológico dos nervos aferentes colônicos de ratos in vitro. Um. Uma ilustração esquemática da preparação do cólon "tubo" ex vivo do rato. O colorreto, com o PG anexado, é superfundido na câmara de registro e é canulado em ambas as extremidades. A infusão intraluminal é obtida usando uma bomba de seringa e se move na direção oral para anal. A distensão do c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pentobarbital Sódico	Xangai Westang Bio-Tech	B558
capsaicina	sigma	M2028
Extrator de eletrodo	MicroData Instrument Inc	PMP107
Sistema Neurolog (Bioamplificador)	Digitimer, Ltd	Sistema Neurolog
Conversor A/D	Design Eletrônico de Cambridge	Micro1401
Software de processamento de dados	Design Eletrônico de Cambridge	Spike2 versão 6
Fio de prata	Instrumentos de precisão mundiais	EP12
Tubos de vidro	Instrumentos de precisão mundiais	1B150-4
Suporte de eletrodo	Instrumentos de precisão mundiais	MEH3SBW
Banho de aquecimento	subvenção	GR150
Microscópio de dissecação	Leica	Zoom2000
Microscópio de dissecação	Instrumentos de precisão mundiais	PZMIII-BS
isqueiro	qualquer	NA
Ferramentas cirúrgicas	Instrumentos de precisão mundiais	NA
Alfinetes de insetos	feito em casa de fio de aço inoxidável de 0,1 mm	NA
Manipulador de três vias	Instrumentos de precisão mundiais	KITF-R
Ratos	qualquer	NA	Qualquer cepa / sexo pode ser usado.