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1. Semear e tratar células endoteliais vasculares cerebrais (CVE) em placas de cultura de células
- Semeie células CVE (células bEnd.3) em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular de 96 poços: 80 μL / poço. Colocar a placa de cultura de células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%. Nota: 16 × 103 células por poço atingirão 60 - 80% de confluência em 24 h.
- Se as células estiverem sendo expostas a um produto químico, adicione os tratamentos assim que as células estiverem presas ao fundo da placa (8 a 24 horas após a semeadura).
nota: Para experimentos de transfecção, não adicione antibióticos em um meio de crescimento completo.
2. Avaliação da função mitocondrial usando o bioanalisador
- Antes do início do ensaio, hidratar um cartucho sensor de fluxo extracelular com calibrante, adicionando 150 μL de solução calibrante de fluxo extracelular à placa e incubando durante a noite a 37 °C sem CO2.
- Usando a estação lavadora de placas, altere o meio de cultura celular para meio de ensaio de fluxo extracelular de pH 7,0. Incubar as células a 37 °C sem CO2 durante 30 - 60 min.
- Prepare soluções de trabalho de oligomicina 8 μM, 4,5 μM de carbonilcianeto 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), 10 μM de rotenona e 10 μM de antimicina A no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Carregue 25 μL das soluções de estoque nas portas de injeção do cartucho: Porta A, oligomicina; Porta B, FCCP; Porta C, rotenona e antimicina A com meio de ensaio de fluxo extracelular. Implemente o protocolo de ensaio conforme descrito na Tabela 1.
- Carregue o cartucho hidratado no bioanalisador e execute a calibração clicando no botão "Iniciar". Após a conclusão da calibração, remova a placa inferior do cartucho e carregue a placa celular clicando no prompt "Descarregar cartucho". Continue o ensaio até que todas as medições estejam concluídas.
- Abra o arquivo de dados e obtenha os valores de taxa do bioanalisador. Exporte os dados para um arquivo de planilha.
Tabela 1. O protocolo de execução de instrumentos.
