Registro da atividade nervosa aferente mesentérica em um segmento de jejuno de camundongo ex vivo

Resumo

Fonte: Nullens, S., et al. Registro in vitro da atividade nervosa aferente mesentérica em segmentos jejunais e colônicos de camundongos. (2016).

Este vídeo mostra o processo de gravação de sinais elétricos dos nervos aferentes mesentéricos em um segmento jejunal de camundongo dissecado para estudar os efeitos da pressão tecidual e das mudanças de movimento na atividade nervosa aferente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do nervo aferente jejunal

1. Realizar a eutanásia de roedores do roedor adolescente ou adulto que tenha sido aprovado antes do experimento pelo Comitê de Ética local (por exemplo, sedação terminal seguida de punção cardíaca, luxação cervical, etc.).
   nota: Usamos a luxação cervical para sacrificar os animais, resultando em experimentos sem a necessidade de anestesia adicional ou cuidados pós-cirúrgicos, pois os tecidos são processados in vitro.
   nota: A idade demonstrou atenuar as funções mecanossensoriais aferentes mesentéricas, portanto, aconselhamos os pesquisadores a aderir a uma faixa etária específica durante um único experimento.
2. Coloque o animal de laboratório sacrificado em decúbito dorsal e faça uma incisão na linha média abdominal através da pele e da camada muscular abdominal usando um bisturi, estendendo-se do apêndice xifóide até o osso púbico.
3. Banhe a cavidade abdominal com solução fria de Krebs para evitar que os tecidos intra-abdominais sequem (composição de Krebs: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH₂PO₄, 15,43 mM NaHCO₃, 1,21 mM MgSO₄, 11,52 mM D-glicose e 1,52 mM CaCl₂).
4. Extirpar rapidamente todo o jejuno com tesoura afiada, excisando aproximadamente 20 cm do intestino delgado começando imediatamente distalmente à flexura duodenojejunal, tomando cuidado para não danificar as estruturas circundantes e mantendo intacto o mesentério intestinal, que contém vasos sanguíneos jejunais e nervos aferentes.
   nota: Para a mera dissecção jejunal na cavidade abdominal, não é necessário o uso de um estereomicroscópio, pois este pode ser facilmente visualizado a olho nu.
5. Coloque o jejuno excisado em uma solução de Krebs gelada e mantenha-o no gelo enquanto oxigena continuamente a solução de Krebs com carbogênio (95% O₂, 5% CO₂).
6. Corte o jejuno com uma tesoura afiada em laços de aproximadamente 3 cm de comprimento. Observe o feixe mesentérico contendo os vasos e o nervo esplâncnico em algum lugar próximo ao centro da respectiva alça.
7. Lave cada segmento com solução de Krebs usando um cateter rombo para remover o conteúdo luminal e o quimo, pois eles contêm enzimas digestivas que acelerarão a deterioração da amostra de tecido in vitro.
   nota: Tome cuidado para não danificar o lúmen da alça durante a lavagem, pois a destruição das vilosidades resultará na liberação de mediadores que podem alterar a atividade nervosa aferente.
8. Identifique o segmento para medir a atividade nervosa aferente (por exemplo, o primeiro segmento jejunal distalmente do ligamento de Treitz ou a flexura duodenojejunal) e coloque-o em uma câmara de registro construída especificamente para esse fim, revestida com uma camada de elastômero de silicone.
   nota: O início do jejuno é anatomicamente definido como a parte do intestino delgado onde o ligamento de Treitz cruza o intestino delgado, também chamada de flexura duodenojejunal.
   nota: Cubra o fundo da câmara de registro com uma fina camada de elastômero de silicone bem antes do início do experimento. Prepare esta camada de elastômero de acordo com as instruções do fabricante.
9. Perfundir constantemente a câmara com uma solução de Krebs quente e carbogenada a uma velocidade de 10 ml/min e manter a temperatura de Krebs na câmara de registo constante a 34 °C.
10. Monte o segmento jejunal no banho do órgão de modo que a extremidade oral seja conectada à chave da seringa que fornece fluxo luminal e a extremidade aboral se conecte ao fluxo de saída. Estique levemente o segmento, mas tome cuidado para não exercer tensão excessiva. Prenda ambas as extremidades firmemente usando ligaduras de seda 4/0 nas portas de entrada e saída.
11. Encaixe o driver da seringa na extremidade oral e perfunda o segmento jejunal por via intraluminal com solução de Krebs (não oxigenada, temperatura ambiente) a uma taxa de 10 ml / h.
12. Use alfinetes de insetos para fixar o mesentério do segmento intestinal montado contra a camada inferior de elastômero de silicone. Estique o mesentério para otimizar a visualização do feixe mesentérico; Não exerça tensão sobre o feixe ou o jejuno.
13. Realize uma distensão de rampa de teste (vide infra) fechando a porta de saída até que a pressão intraluminal do segmento intestinal atinja 60 mmHg para verificar se nenhuma solução de Krebs intraluminal está vazando do segmento montado. Observe um aumento suave da pressão intraluminal sem interrupções.
14. Observe pequenas contrações do segmento (ondas peristálticas) durante a fase inicial de distensão. Se necessário, bloqueie a atividade peristáltica adicionando 1 μM do bloqueador dos canais de cálcio tipo L nifedipina à solução de Krebs.
    nota: A adição de 1 μM de atropina à solução de Krebs, além da nifedipina, paralisará completamente o segmento intestinal.
15. Sob um estereomicroscópio, comece a descascar suavemente o tecido adiposo do mesentério, puxando-o suavemente com duas pequenas pinças, tomando cuidado para não danificar os vasos e o nervo aferente que estão enterrados no tecido adiposo.
16. Comece a uma distância remota do jejuno e exponha os dois vasos sanguíneos no feixe mesentérico.
17. Observe o nervo jejunal aferente entre os dois vasos como um fio fino e branco encapsulado em tecido adiposo. Dissecar apenas mais proximalmente em direção ao jejuno, retirando suavemente o tecido adiposo com uma pinça, quando a identificação inicial de ambos os vasos mesentéricos e/ou do nervo aferente for difícil.
18. Dissecar o nervo mesentérico jejunal do segmento livre a uma distância de vários milímetros, removendo o tecido adiposo aderente ao nervo.
19. Traneccione o nervo usando uma tesoura de tecido afiada. Se necessário, retire a gordura restante e o tecido conjuntivo, bem como a bainha epineuronal, puxando-a suavemente com as pequenas pinças.
20. Com o auxílio de um micromanipulador, abaixe a ponta do eletrodo de sucção, conectada a uma seringa com êmbolo, no banho do órgão; em seguida, manipulando o êmbolo, aspire suavemente um pouco da solução de Krebs do banho do órgão de modo que a ponta do eletrodo fique submersa na solução de Krebs (Figura 1). Certifique-se de que a solução de Krebs cubra o eletrodo de arame dentro do eletrodo de sucção.
    nota: Use um extrator de pipeta para preparar o capilar de sucção de vidro de borossilicato contendo o eletrodo de arame antes do início do experimento.
21. Posicione a ponta do eletrodo de sucção imediatamente ao lado da fita nervosa aferente seccionada e puxe a fita nervosa seccionada para o capilar em todo o seu comprimento.
22. Manobre a ponta do eletrodo em direção a algum tecido adiposo e aspire-o para o capilar de vidro enquanto aspira firmemente com o êmbolo, "selando" mecanicamente o nervo no capilar do conteúdo do banho do órgão.
23. Verifique o registro da atividade nervosa aferente usando o sistema de aquisição de dados, por exemplo, realizando um aumento induzido pela distensão da rampa no disparo aferente (vide infra). Após o isolamento do nervo no eletrodo de sucção, estabilize a preparação por 15 minutos para obter um estado estável de atividade nervosa aferente espontânea antes de realizar os experimentos reais.
24. Para realizar a distensão em rampa, distenda o segmento intestinal fechando a porta de saída, levando a um aumento gradual da pressão (até 60 mmHg). Execute o protocolo experimental desejado somente quando três distensões consecutivas da rampa (com intervalo de 15 minutos) produzirem uma descarga reprodutível de várias unidades (Figura 2).

Resultados

Figura 1: Visão geral esquemática da câmara de gravação e do eletrodo de sucção construídos para esse fim. Visão geral detalhada da configuração técnica com o eletrodo de sucção e a câmara de gravação instalada.

Figura 2: Rastreamento representativo do registro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio (NaCl)	Produtos químicos da VWR	2,78,10,295	solução composta de Krebs
Cloreto de potássio (KCl)	Acros orgânicos	196770010	solução composta de Krebs
Dihidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4)	Produtos químicos da VWR	1,06,34,61,000	solução composta de Krebs
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	solução composta de Krebs
Sulfato de magnésio (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	solução composta de Krebs
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	solução composta de Krebs
D-glicose	Produtos químicos da VWR	1011175P	solução composta de Krebs
água destilada			solução composta de Krebs
Tubulação de PVC	Suprimentos de Laboratório Científico		O segmento intestinal deve ser montado sobre tubos de PVC
Tubos de silicone	Suprimentos de Laboratório Científico		O resto da tubulação, idealmente à base de silicone - desalojamento mais fácil de detritos na tubulação
Fio de seda	Pearsall Limitada	10B15S220	Fixação do segmento sobre a tubulação de PVC
Driver de seringa	Aparelho de Harvard	Telefone: 55-2222	Infusão intraluminal de Krebs
Binóculo - incluindo ampliação de 10x no oculair	Zeiss STEMI 2000		Visualização ideal para a dissecção do nervo aferente
Unidade de controle de manta homeotérmica	Aparelho de Harvard	507214	Aquecimento da câmara do órgão
Banho de órgão feito sob medida com fundo coberto de Sylgard
Software Spike2			Registro e análise dos dados
Alfinetes para insetos, 500 peças, aço inoxidável, diâmetro 0,2 mm	O inseto de Austerlitz fixa minutiens		Dissecção do nervo aferente
Pinça Dumont #5 inox 11cm	Instrumento de precisão mundial	500341	Dissecção do nervo aferente
Tesoura, mola, 14 cm	Instrumento de precisão mundial	15905	Dissecção do nervo aferente
DB digitimer	NL 108T2/10		Transdutor de pressão
Micromanipulador	Narishige	M-3333	Manipulação 3D do eletrodo de sucção
Micromanipulador	Bloco rotativo X-4		Manipulação 3D do eletrodo de sucção
Micromanipulador	Suporte magnético GJ-8		Manipulação 3D do eletrodo de sucção
Fonte de luz	Microscópios Euromex Holland EK-1		Visualização ideal para a dissecção do nervo aferente
Aparelho de Gravação CED 1401			Registro da atividade nervosa aferente
Eliminador de ruído Humbug 50/60Hz	Quest Scientific Instruments		Eliminação do ruído de fundo
Bomba de infusão	Gibson Minipuls 2		Infusão da câmara do órgão na qual o segmento é montado
Suporte de Microeletrodo Meias Células 1,5 mm	Instrumento de precisão mundial	MEH2SW	Eletrodo de sucção para isolamento da fibra aferente
Capilares de vidro borossilicato, 300 peças; 1,5/0,84 OD/ID	Instrumento de precisão mundial	1B150-4	Capilar para o isolamento do nervo aferente