Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Resumo

Fonte: Ackels, T., et al. Análise Fisiológica Aprofundada de Populações de Células Definidas em Fatias de Tecido Agudo do Órgão Vomeronasal de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação da solução

1. Prepare a solução extracelular tamponada com solução extracelular S₁: 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES) contendo (em mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado com NaOH); osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glicose).
2. Prepare a solução extracelular S₂: Solução extracelular oxigenada com carbógeno (95% O₂, 5% CO₂) contendo (em mM) 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 ácido bis (2-hidroxietil) -2-aminoetanossulfônico (BES); pH = 7,3; osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glicose).
3. Prepare solução de agarose de baixa temperatura de gelificação a 4% (S₃) para inclusão de tecido: agarose de baixa temperatura de gelificação a 4%. Dissolver 2 g de agarose pouco gelificante em 50 ml de S₁ num frasco de laboratório de vidro de 100 ml, juntamente com um agitador magnético. Para derreter a agarose, coloque o frasco em banho-maria (com a tampa bem fechada) a 70 °C por aproximadamente 20 min ou até que a solução fique transparente enquanto agita. Arrefecer e manter a agarose derretida num segundo banho-maria a 42 °C até nova utilização.
4. Preparar a solução intracelular S₄: Solução de pipeta contendo (em mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 ácido etilenoglicol tetracético (EGTA), 0,3 CaCl₂ (Ca livre²⁺ = 110 nM), 10 HEPES, 2 sal de adenosina 5′-trifosfato de magnésio (MgATP), 1 sal de guanosina 5′-trifosfato de sódio (NaGTP); pH = 7,1 (ajustado com KOH); osmolaridade = 290 mOsm.
5. Modificar/ajustar a composição de S₁, S₂ e S₄ de acordo com o projeto experimental individual (por exemplo, bloqueadores farmacológicos para isolar certos tipos de correntes ativadas por tensão).

2. Dissecação e incorporação de VNO

1. Sacrifique o animal por breve exposição ao CO₂ e decapite usando uma tesoura cirúrgica afiada. Nota: Como o tempo desde o sacrifício do animal até a colocação da cápsula VNO no gelo é crítico, minimize o tempo para menos de 2 min. Para manter a viabilidade do tecido, incorpore os dois VNOs totalmente dissecados em agarose em menos de 30 min.
2. Remova a mandíbula inferior com uma tesoura cirúrgica grande. Entre pela cavidade bucal e corte os ossos da mandíbula e os músculos de cada lado separadamente.
3. Coloque a parte restante da cabeça de cabeça para baixo na placa de Petri grande.
4. Afaste a pele da mandíbula superior e ao redor da ponta do nariz com uma pinça média para obter melhor acesso aos incisivos.
5. Use uma tesoura de osso para cortar a maior parte dos incisivos em um ângulo de ~ 45 ° na direção rostral (Figura 1A). Isso facilitará a remoção da cápsula VNO da cavidade nasal.
   nota: Não corte até a raiz do dente para evitar danos à ponta da cápsula VNO.
6. Agarre o palato superior rígido em sua parte rostral com uma pinça média e retire cuidadosamente em uma peça em um ângulo plano (Figura 1B).
   nota: Enxaguar repetidamente com S 2 gelado.
7. Use uma tesoura de micromola para cortar a fusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula. Insira as pontas da tesoura com a parte curva da ponta apontando para fora, longe do VNO e corte cuidadosamente o osso em pequenos passos no lado esquerdo e direito lateral da cápsula VNO.
8. Para remover a cápsula VNO, use uma tesoura de micromola para cortar o osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer para fora da cavidade nasal usando uma pinça média. Transfira imediatamente o VNO para uma pequena placa de Petri sob um microscópio estéreo em uma bolsa de gelo gel, onde as etapas restantes da dissecção serão realizadas.
9. Enxágue o VNO em uma pequena quantidade de S₂ gelado para evitar que o tecido seque.
10. Separe as cápsulas cartilaginosas que contêm os tecidos moles do VNO agarrando a parte de trás do osso vômer com uma pinça média. Posicione a cápsula para uma vista dorsal de modo que uma divisão entre os dois VNOs se torne visível (Figura 1D_i).
11. Use a ponta da pinça fina para separar ambas as cápsulas de VNO da cartilagem do osso central, mantendo o osso vômer preso na parte traseira.
    nota: Use uma pinça apenas na borda da cápsula de cartilagem e tenha muito cuidado para não perfurar a cartilagem, pois o delicado epitélio sensorial é facilmente danificado.
12. Uma vez que os dois VNOs estejam separados, comece a remover a cartilagem encapsulando o primeiro VNO.
13. Pegue a borda superior da cápsula com uma pinça fina e separe a parede da cartilagem que estava anteriormente presa ao osso vômer (lado medial).
14. Para remover a cartilagem restante, gire o VNO com o lado lateral curvo para o fundo do prato e prenda firmemente a cartilagem de um lado usando uma pinça. Mova cuidadosamente a segunda pinça fina da parte de trás em um ângulo muito plano entre a cartilagem e o VNO para afrouxar a conexão entre o tecido e a cartilagem.
15. Lentamente, retire o VNO da cartilagem, segurando-o na ponta caudal, para evitar danificar o epitélio sensorial.
16. Uma vez que o VNO é alavancado da cápsula, certifique-se de remover todas as pequenas partes de cartilagem restantes, pois quaisquer pedaços restantes de cartilagem separarão o tecido da agarose circundante durante o processo de corte.
17. Coloque uma pequena gota de S₂ gelado no primeiro VNO dissecado para evitar danos aos tecidos. Um grande vaso sanguíneo no lado lateral se tornará visível, indicando que o órgão ainda está intacto e não foi gravemente danificado durante a dissecção (Figura 2A_ii). Caso o vaso sanguíneo tenha sido danificado, ainda valerá a pena continuar cortando o VNO, desde que a morfologia geral não tenha sido claramente prejudicada.
18. Disseque imediatamente o segundo VNO.
19. Para incorporar os VNOs, encha as duas pequenas placas de Petri até a borda com S₃ derretido (armazenado em banho-maria a 42 ° C; ver 1.3).
20. Segure o VNO na extremidade caudal mais larga com uma pinça fina para evitar danos ao epitélio sensorial.
21. Mergulhe o VNO na agarose e mova-o horizontalmente para frente e para trás várias vezes para remover o filme de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar de sua superfície.
22. Posicione o VNO verticalmente com a ponta caudal voltada para o fundo do prato. Em vez de apertar o VNO diretamente com a pinça, ajuste a orientação movendo a ponta da pinça nas proximidades do VNO.
    nota: A orientação durante a incorporação é crucial, pois determina o plano de corte e a acessibilidade aos neurônios sensoriais durante o experimento.
23. Coloque os pratos na bolsa de gelo em gel e espere até que a agarose solidifique.
    Nota: Não altere a orientação do VNO depois que a agarose começar a solidificar, pois isso desprenderá o tecido da agarose circundante.

3. Fatiamento de tecido VNO coronal

1. Use uma pequena espátula para remover o bloco de agarose do prato pequeno para a tampa de uma placa de Petri grande, vire o agarose de cabeça para baixo deixando a ponta caudal do VNO voltada para cima.
2. Corte o bloco em forma piramidal usando um bisturi cirúrgico (3-4 mm na ponta, 8-10 mm na parte inferior). Tome cuidado para não danificar o tecido embutido.
3. Use super cola para fixar o bloco em forma de pirâmide no centro da placa de amostra de vibratomo e espere ~ 1 min para que a cola seque completamente.
4. Transfira a placa de amostra para a câmara de fatiamento e prepare o segundo VNO, de acordo. Manter a placa com a segunda amostra a 4 °C até à utilização.
5. Use um micrótomo de lâmina vibratória com as seguintes configurações: espessura: 150-200 μm; velocidade: 3,5 u.a. = 0,15 mm/seg; frequência: 7,5 u.a. = 75 Hz. Transfira as fatias para a câmara de oxigenação até o uso após inspecionar brevemente a morfologia das fatias sob o microscópio de dissecação. As fatias podem ser mantidas por várias horas.

4. Registros eletrofisiológicos de célula única

1. Para gravações, use um microscópio vertical de estágio fixo equipado com objetivas de imersão em água, Dodt ou contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) e epifluorescência, bem como uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) resfriada. Para aquisição de dados, use um patch-clamp amplificador, cabeçote stage, placa de interface analógico-digital / digital-analógico (AD/DA) e um computador (incluindo software de gravação).
2. Prepare um estoque de 10-20 pipetas de remendo (4-7 MΩ). Puxe pipetas de capilares de vidro borossilicato (1,50 mm de diâmetro externo [OD]/0,86 mm de diâmetro interno [ID]) usando um extrator de micropipeta e polidor de fogo com uma microforja.
   nota: O polimento a fogo das pontas da pipeta é crucial ao remendar os VSNs bastante pequenos. Isso ajudará a evitar a ruptura da membrana celular ao aplicar pressão negativa para obter uma vedação de alta resistência. Após o polimento, a abertura da pipeta deve ser de aproximadamente 1 μm.
3. Mantenha as pipetas em um frasco de armazenamento de pipetas para evitar danos e acúmulo de poeira até o uso.
4. Preparar o sistema de perfusão enchendo reservatórios de solução e tubulação de acordo com o planejamento experimental.
   nota: Remova completamente as bolhas de ar da tubulação, pois elas interferem fortemente nos registros eletrofisiológicos.
5. Ajuste a pressão para atingir o fluxo de ~3 ml/min.
   nota: Altas pressões causarão movimento da fatia de tecido, bem como o término dos registros eletrofisiológicos.
6. Transferir o corte VNO para a câmara de imagem e fixar a posição do corte usando âncora de aço inoxidável com fios > de espessura nota: Não cubra a fatia de tecido com um dos fios de fibra sintética, mas sim com a agarose ao redor da fatia.
7. Transfira a câmara de imagem para a configuração de gravação e superfunda continuamente a fatia com S₂ oxigenado à temperatura ambiente por meio de uma aplicação de banho.
8. Ajuste o capilar de sucção à superfície da solução para criar uma sucção lenta para troca constante da solução do banho. Ajuste o "lápis de perfusão" multi-barril 8 em 1 acima e próximo à parte não sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A). Será benéfico organizar o lápis de perfusão e a pipeta de gravação voltados para a fatia em direções opostas.
9. Conecte o eletrodo de referência e a solução de banho usando uma ponte de ágar em forma de L (preenchida com 150 mM KCl).
10. Encha a pipeta com a solução de pipeta S₄.
11. Monte a pipeta sobre o eletrodo remendo revestido de cloreto de prata conectado ao estágio principal sem raspar o revestimento e prenda firmemente.
12. Aplique uma leve pressão positiva (aproximadamente 1 ml em uma seringa de plástico de 10 ml) na pipeta antes de entrar no banho.
13. Abaixe a pipeta no banho usando micromanipuladores o suficiente para poder submergir a objetiva sem atingi-la (Figura 2D).
14. Monitore a resistência da pipeta (R_pip, entre 4-7 MΩ) usando um software de eletrofisiologia conectado ao estágio principal.
    nota: Se R_pip for <4 MΩ, a ponta do vidro está quebrada. Se R _pip for >10 MΩ, a ponta provavelmente está entupida e a pipeta deve ser substituída.
15. Visualize a fatia VNO com uma câmera CCD usando contraste de interferência diferencial (DIC) otimizado para infravermelho e identifique células que expressam FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: sequência 3 relacionada ao receptor de peptídeo formila) (ou neurônios marcados de forma semelhante) usando iluminação de fluorescência e um cubo de filtro apropriado.
16. Concentre e direcione células fluorescentes ou não fluorescentes, dependendo do projeto experimental.
17. Para se aproximar do corpo da célula, use volantes para obter a máxima sensibilidade. Devido à pressão positiva, um pequeno amassado na membrana do soma celular torna-se visível quando a ponta da pipeta está próxima.
18. Libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para sugar a membrana celular para obter uma vedação de alta resistência (1-20 GΩ). Aplique sucção curta e suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de toda a célula.
19. Monitore a resistência de acesso constantemente durante experiment.
    nota: Inclua apenas neurônios exibindo resistência de acesso pequena e estável (≤3% da_entrada R; mudança <20% ao longo do experimento) em análise.

Resultados

Figura 1: Dissecção do VNO. (A) Vista lateral da cabeça do mouse para ilustrar a posição e o ângulo em que os incisivos são cortados. (B) Vista ventral representando o melhor ponto para agarrar e descascar o palato superior (UP). (C) Visão ventral da cápsula cartilaginosa (CC) que abriga o VNO e o osso vômer (VB) após a remoção da mandíbula inferior,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos
Agarose (baixa temperatura de gelificação)	PeqLab	35-2030
ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	Resposta A9187
Ácido bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfónico (BES)	Sigma-Aldrich	B9879
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016
Ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
glicose	Sigma-Aldrich	G8270
GTP (Na-GTP)	Sigma-Aldrich	Rolamento 51120
Ácido (2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	Pág. 9333
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	3564
cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Hidrogenocarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761
hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S8045
Ferramentas e consumíveis cirúrgicos
Placa de Petri grande, 90 mm	VWR		decapitação, dissecção da cápsula VNO
Placa de Petri pequena, 35 mm	VWR		tampa para dissecção VNO, prato para embutir em agarose
Tesoura cirúrgica grande afiada	Ferramentas de Belas Ciências		decapitação, remoção da mandíbula inferior
Tesoura de osso forte	Ferramentas de Belas Ciências		incisivos cortantes
Fórceps médio, pinça Dumont #2	Ferramentas de Belas Ciências		Remoção de pele e palato
Micro tesoura de mola, 8,5 cm, curva, lâminas de 7 mm	Ferramentas de Belas Ciências		cortando VNO
Dois pares de pinças finas, pinças Dumont #5	Ferramentas de Belas Ciências		dissecar VNO fora da cápsula cartilaginosa
Espátula pequena de aço inoxidável	Ferramentas de Belas Ciências		Manuseio de blocos de agarose e fatias de tecido
Bisturi cirúrgico			Corte de bloco de agarose em forma piramidal
equipamento
amplificador	HEKA Elektronik	EPC-10
Capilares de vidro borossilicato (1,50 mm OD/0,86 mm ID)	Produtos Científicos
Câmera CCD	Leica Microsystems	DFC360FX
Cubo de filtro, excitação: BP 450-490, supressão: LP 515	Leica Microsystems	I3
Lâmpada de fluorescência	Leica Microsystems	EL6000
Agitador magnético de placa quente	Snijders	Rolamento 34532
Microforja	Narishige	MF-830
Dispositivo micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5
Extrator de micropipetas, vertical de duas etapas	Narishige	PC-10
microscópio	Leica Microsystems	CSM DM 6000 SP5
Eliminador de ruído 50/60 Hz (HumBug)	Quest Scientific
objetivo	Leica Microsystems	HCX APO L20x/1,00 W
osciloscópio	Tektronik	TDS 1001B
Osmômetro	Gonotec	Osmomat 030
Sistema de perfusão 8 em 1	AutoMate Científico
Medidor de pH cinco fácil	Mettler Toledo
Frasco de armazenamento de pipetas	Instrumentos de precisão mundiais	e212
Câmara de gravação	Luigs & Neumann	Mini câmara de fatia
Lâminas	Wilkinson Sword GmbH	Espada Clássica Wilkinson
Câmara de armazenamento de fatias oxigenantes; câmaras comerciais alternativas são, por exemplo, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) ou a Pré-câmara (BSC-PC; Warner Instruments)	sob medida
Microscópio estéreo	Leica Microsystems	S4E
Interface de gatilho	HEKA Elektronik	TIB-14 S
Vibratomo	Leica Microsystems	VT 1000 S
Banho-maria	Memmert	WNB 45