Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Medicamentos para microiontoforese
NOTA: Os medicamentos utilizados para microiontoforese devem ter carga elétrica quando dissolvidos em água. Verifique a literatura para ver se o medicamento de interesse é apropriado para este procedimento. Aqui, o procedimento para gabazina, um antagonista do receptor GABAA, é descrito.
- Filtre a água destilada usando um filtro de seringa de 0,2 μm para esterilizá-la e garantir que não contenha solutos. Usando esta água destilada, prepare ~ 1.000 μl de gabazina 20 mM.
- Ajustar o pH da diluição para 4 com NaOH filtrado a 0,2 μm utilizando um eléctrodo de pH de ponta fina.
- Armazenar alíquotas de 100 a 200 μl a -20 ° C. Descongelar no dia do registo. Nesse dia, antes de o animal ser contido, encha os barris (3 - 5 μl) do eletrodo multicil com os medicamentos, usando uma microsseringa de 100 μl equipada com uma agulha plástica flexível.
2. Cirurgia e implante de headpost
- Realizar experimentos em dois camundongos machos CBA/J (Mus musculus) com pesos de 27 e 30 g.
- Nos dias que antecedem a cirurgia, manuseie os animais e permita que eles explorem livremente na câmara de gravação para habituá-los a ela. Realize três sessões por dia, cada uma com duração de pelo menos 30 minutos. Isso irá acalmá-los e deixá-los confortáveis durante as gravações.
- Anestesiar o camundongo usando uma mistura de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) injetada por via intramuscular. Esta dose anestesia profundamente o animal por cerca de 1 hora. Administre doses suplementares de um terço da dose inicial, conforme necessário.
- Coloque o animal em um cobertor de aquecimento ajustado para manter uma temperatura de 38 ± 1 ºC e estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica usando duas barras auriculares e uma barra de mordida. Tenha cuidado para não perfurar a membrana timpânica com as barras auriculares.
- Proteja os olhos aplicando uma gota de gel oftálmico.
- Raspe o couro cabeludo com uma tesoura e aplique iodopovidona para desinfetar a pele.
- Usando um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre o parietal e a parte mais rostral dos ossos occipitais.
- Cole um espigão de duralumínio leve (peso ~ 0,65 g, comprimento 30 mm, Figura 1A) com uma base redonda e plana (5 mm de diâmetro) no crânio. Cole um fio de prata no meio do espigão deixando as pontas livres. O fio de prata será utilizado como eletrodo de referência para o registro eletrofisiológico.
- Aplique uma fina camada de adesivo fotopolimerizável no crânio e na base do espigão de cabeça. Aguarde 10 segundos e coloque o cabeçote sobre a área rostral dos ossos parietais, ao longo da linha média.
- Fotopolimerize o adesivo usando uma fonte de luz azul por 20 segundos para uma força de colagem eficaz.
- Faça três furos ao redor e atrás da base do espigão usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena.
- Coloque dois parafusos de relógio (~ 2 mm de comprimento) nos orifícios perfurados para servir como pontos de contato adicionais entre o crânio e o headstage. Os parafusos requerem 1 1/2 voltas para obter um ajuste confortável. Teste os parafusos com uma pinça para se certificar de que não estão soltos.
- Insira a ponta do fio terra prateado no terceiro orifício, certificando-se de que ele entre em contato com a dura-máter. Aplique uma pequena gota de cola de cianoacrilato resistente à água para prender o fio ao crânio.
- Aplique compósito fotopolimerizável para reforçar a ligação do espigão com o crânio. Cubra a base do espigão de cabeça, a parte inferior do fio prateado e os parafusos, tomando cuidado para não se estender atrás do lambda para permitir o acesso durante a gravação. Catalise usando uma fonte de luz azul.
- Retraia o músculo na parte de trás do pescoço perto de sua inserção no crânio. Usando uma pequena trefina (2,35 mm de diâmetro), perfure uma janela redonda logo abaixo da sutura lambda e lateral à linha média, para expor o colículo inferior (CI). Puxe o osso de cobertura com uma pinça fina quando as bordas estiverem soltas. Se ocorrer sangramento, enxágue com solução salina estéril fria para interrompê-lo.
- Use compósito para fazer uma pequena parede (~ 1 mm de largura e ~ 1 mm de altura) ao redor da janela e fotopolimerizá-la.
- Cubra o crânio e o músculo expostos com pomada antibiótica. Em seguida, molhe a superfície exposta do CI com soro fisiológico estéril e cubra-o com vaselina, enchendo o poço gerado após fazer a parede ao redor da janela de gravação.
- Injete buprenorfina por via subcutânea (0,03 mg / kg, diluída 1:10 em solução salina estéril) como analgésico.
- Mantenha o animal no cobertor de aquecimento até que ele acorde e devolva-o à gaiola para se recuperar da cirurgia por três dias antes das sessões de gravação. Animais domésticos em gaiola de alojamento de rato individual para evitar que os companheiros de gaiola limpem a geléia e o poste da cabeça tocando a tampa da grade de metal. Coloque algum enriquecimento na gaiola quando o animal for alojado individualmente. Além disso, troque a serragem diariamente para evitar infecções e verifique cuidadosamente se o animal se recupera adequadamente e não mostra sinais de desconforto. Além disso, verifique se a vaselina está sobre a janela de gravação protegendo o cérebro exposto.
3. Registro eletrofisiológico e microiontoforese
- Após a recuperação, dê tempo ao animal para se acostumar com o ambiente de gravação e ter sua cabeça presa. Aclimate o animal fixando o espigão de cabeça ao suporte enquanto o rato se senta em um sistema de retenção de espuma acolchoado feito sob medida, esculpido no tamanho do corpo (Figura 1B). Isso limitará os movimentos do mouse e contribuirá para sua calma.
- Comece com sessões de 10 minutos e aumente progressivamente a duração até 120 minutos. Durante a sessão, recompense os animais com líquidos doces (leite condensado, diluído 30:70 em água) em determinados intervalos. Mais tarde, durante a sessão de gravação, dê a mesma recompensa no início e no final da sessão ou enquanto nenhum neurônio estiver isolado.
- Se o animal estiver excitado antes da gravação, injete o sedativo leve acepromazina (2 mg / kg, intraperitoneal). De acordo com o sistema neural de interesse, o sedativo pode afetar seus resultados.
- Deixe o animal explorar livremente a câmara de gravação por 5 a 10 min.
- Coloque o corpo do animal no sistema de retenção almofadado de espuma feito sob medida (Figura 1B).
- Prenda o espigão de cabeça a um suporte preso à estrutura estereotáxica (Figura 1C). Este é um bom momento para dar ao animal uma recompensa líquida.
- Cubra o corpo do animal com um cobertor de algodão e prenda-o frouxamente com um hemicilindro de plástico e fita adesiva.
- Remova a vaselina da janela de gravação e enxágue com solução salina estéril morna.
- Registre a atividade neural e a aplicação iontoforética de gabazina.
- Coloque o eletrodo multibarril em seu suporte, controlado por um microdrive e conectado a um micromanipulador.
- Conecte os fios para gravação usando pequenos clipes de crocodilo. Conecte o terminal positivo à extremidade do eletrodo de tungstênio e o terminal de aterramento ao fio prateado que entra em contato com a dura-máter.
- Coloque um fio de prata não revestido dentro de cada barril de forma que uma extremidade entre em contato com a solução e a outra fique acessível. Conecte essas extremidades ao dispositivo de microiontoforese, seguindo as instruções do fabricante.
- Mova o eletrodo multibarril até que a ponta entre em contato com a superfície do cérebro. Aplique solução salina estéril quente para evitar a dessecação do tecido cerebral. Nesse ponto, aplique uma corrente de retenção (-10 nA para gabazina; verifique a literatura para o medicamento específico) para evitar vazamento do medicamento da ponta do barril enquanto procura atividade de unidade única.
- Use técnicas padrão para isolar a atividade extracelular de um único neurônio. Obtenha a área de resposta em frequência (FRA) do neurônio, ou seja, a combinação de frequências e intensidades capazes de evocar uma resposta porque o neurônio é sensível a esses sons.
- Escolha duas frequências (f1 e f2) que evoquem uma taxa de disparo e padrão semelhantes. Apresente cada uma dessas frequências como estímulo raro e repetitivo sob o paradigma excêntrico.
nota: Resumidamente, no paradigma oddball, uma frequência (f1) é apresentada como o estímulo repetitivo com alta probabilidade de ocorrência, enquanto a segunda (f2) é o estímulo desviante de ocorrência rara, intercalado aleatoriamente entre os repetitivos. Em uma segunda sequência excêntrica, as probabilidades relativas dos dois estímulos são invertidas.
- Libere a gabazina mudando a corrente para valores positivos (10 - 20 nA). Obtenha o FRA novamente e repita o paradigma excêntrico sob a aplicação de gabazina. Manter a ejeção até que se observe um efeito visível na velocidade de disparo; geralmente leva de 5 a 20 minutos, dependendo do medicamento específico, sua concentração e a magnitude da corrente de ejeção. Repita o protocolo de registro para obter os valores sob o efeito do medicamento.
- Pare a injeção retornando a corrente para valores de retenção. Aguarde até que o efeito da droga desapareça, monitorando se a FRA ou a resposta ao paradigma excêntrico retorna aos valores de controle.
nota: As sessões de gravação podem durar de 2 a 3 horas por dia e devem ser encerradas mais cedo se o animal mostrar algum sinal de desconforto ou luta. Dê recompensa líquida e cubra a câmara de gravação com vaselina.
