Registro da Atividade Eletrofisiológica da Rede Neuronal em uma Co-cultura Neurônio-Astrócito

Resumo

Fonte: Taga, A., et al. Estabelecimento de uma Plataforma Eletrofisiológica para Modelagem de ELA com Astrócito Humano Pluripotente Derivado de Células-Tronco Pluripotentes Regionalmente Específicas J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura neurônio-astrócitos para registrar a atividade da rede neuronal. Ao estabelecer a co-cultura de neurônios motores e astrócitos em uma placa multi-electrode array (MEA), a atividade elétrica rítmica síncrona da rede neuronal foi registrada extracelularmente usando o MEA.

Protocolo

1. Co-cultura de astrócitos MN e da medula espinhal em placas de matriz de múltiplos eletrodos

1. Diferenciar e plaquear os neurônios motores e astrócitos quando estiverem prontos para serem usados no mesmo dia e envelhecidos no dia in vitro (DIV) 60 para os neurônios motores e DIV 90 para os astrócitos.
2. Cubra as placas MEA no dia anterior ou no dia do revestimento da seguinte forma se estiver trabalhando com placas plásticas de 24 poços (Tabela de Materiais).
3. Dilua a poliornitina (OLP) em água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 100 μg/mL.
   1. Adicione 15-20 μL a cada poço (dependendo do nível de conforto da pipeta), formando uma gota no centro do poço cobrindo a área dos eletrodos e a área circundante, mas não a totalidade do poço.
   2. Tome cuidado para não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Seja consistente com o volume de poço a poço para garantir a cobertura da mesma área de superfície em cada poço.
   3. Incubar o PLO a 37 °C por um mínimo de 1 h (de preferência 2 h).
      nota: Os pequenos volumes secarão se não houver umidade suficiente nas placas. Adicione água aos compartimentos ao redor dos poços para garantir umidade suficiente durante todo o processo de revestimento e gravações.
4. Aspire o máximo de PLO possível usando uma ponta de micropipeta de plástico. Tome cuidado para não tocar nos eletrodos. Lave com 250 μL de água três vezes. Se estiver usando um aspirador a vácuo para lavagens, não permita que a ponta se aproxime do feixe de eletrodos. Após a terceira lavagem, remova o máximo de água possível, usando uma ponta de pipeta conforme necessário. Deixe a superfície secar sob a capa de cultura de células com a tampa removida.
5. Quando as superfícies das placas estiverem secas, adicione laminina diluída a 10 μg/mL em PBS. Use 15-20 μL para cobrir cada feixe de eletrodos. Adicione água aos compartimentos de umidade, recoloque a tampa e retorne a placa à incubação a 37 ° C por um mínimo de 2 h até a noite.
6. No dia do plaqueamento, enxágue as culturas de neurônios motores (MN) e astrócitos uma vez com PBS e adicione tripsina 0,05% a 37 ° C para levantar as células (5 min). Colete em um tubo cônico de 15 mL contendo inibidor de tripsina e lave as placas com meio ou base para garantir que todas as células sejam coletadas. Centrifugue a 300 x g por 5 min e ressuspenda com uma pipeta de 1000 μL para gerar 1 mL de uma única suspensão celular. Ao ressuspender MN e astrócitos, mude para o meio de co-cultura (Tabela 1), com a adição de 20 μM de inibidor da proteína serina/treonina quinase formadora de bobina enrolada associada a Rho (ROCK-I).
7. Conte o MN e os astrócitos em paralelo usando um hemocitômetro. Enquanto conta e faz cálculos, tampe as suspensões das células e coloque-as em um rack de isopor a 4 °C.
8. Calcule o volume necessário para ressuspender as culturas a uma concentração de 5 x 10⁴ células por 5 μL para neurônios motores e 2,5 x 10⁴ células por 5 μL para astrócitos. Centrifugue as suspensões de células de 1 mL a 300 x g por 5 min e ressuspenda no volume calculado.
9. Calcule o número de poços desejados a serem semeados e multiplique por 5 μL de cada suspensão celular. Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos na proporção de 1:1 e misture pipetando até que estejam completamente combinados (geralmente duas vezes), mas evite ser muito agressivo.
10. Remova a laminina de cada poço da placa MEA usando uma ponta de pipeta. Transfira 10 μL da suspensão celular combinada final para cada poço, formando uma pequena gotícula cobrindo o feixe de eletrodos para fornecer uma densidade celular de 5 x 10⁴ MN e 2,5 x 10⁴ astrócitos por poço.
    nota: A alta densidade celular na suspensão combinada requer ressuspensão frequente entre os poços durante a etapa de semeadura para garantir contagens de células precisas e consistentes.
11. Retorne as placas para a incubadora por 20-30 min. Tome cuidado para não perturbar a gotícula celular e permitir que as células formem ligações iniciais nas placas.
12. Após 20-30 min, adicione meios de co-cultura quentes + ROCK-I a cada poço pipetando 250 μL na parede de cada poço, seguido por 250 μL adicionais na parede do mesmo poço no lado oposto. Retorne a placa para a incubadora.
13. Examine as placas no dia seguinte à semeadura (Co-cultura Dia 1). Se houver detritos celulares significativos ou células mortas, troque o meio por um meio de co-cultura fresco contendo ROCK-I. Caso contrário, mude o meio no segundo dia após a semeadura (Co-Cultura Dia 2) para o meio de co-cultura sem ROCK-I. Realizar trocas de meio meio (aspirar 50% e adicionar 60% do volume final para contabilizar a evaporação) duas vezes por semana.
14. Se estiver usando sistemas MEA com placas de vidro de 30 mm de poço único (Tabela de Materiais), a preparação da placa pode levar 2 ou mais dias. Siga as etapas abaixo para fazer isso.
15. Levante as células e detritos celulares das culturas MEA anteriores com 0,05% de tripsina por 5-15 min.
16. Aspire a tripsina e enxágue três vezes com água.
17. Esterilize adicionando etanol a 70% e incube no exaustor por 10 min. Aspire o etanol e depois enxágue com água três vezes.
18. Aplique detergente aniônico a 1% com enzima protease em água. Cubra os pratos com uma tampa e embrulhe com filme termoplástico e papel alumínio e, em seguida, deixe-os em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente durante a noite.
19. Aspire o detergente e depois enxágue três vezes com água.
20. Se estiver planejando armazenar as placas, adicione um volume suficiente de água. Cubra os pratos com uma tampa e embrulhe-os com filme termoplástico e papel alumínio e deixe-os na geladeira até o próximo uso.
21. Se estiver planejando revestir, deixe a superfície secar sob a capa de cultura de células.
22. Se for necessária esterilização extra (por exemplo, infecção anterior ou uso não recente), somente neste ponto, exponha as placas MEA à luz ultravioleta (UV) sob o capô por 30-60 min.
    nota: Evitar a luz UV frequente evitará danos aos eletrodos. O uso de luz ultravioleta quando as placas contêm soro resultará em eletrodos não funcionais, razão pela qual ela só deve ser usada em placas limpas.
23. Quando as placas estiverem completamente secas, prossiga com a limpeza a plasma por 1 minuto para carregar a superfície de vidro das placas MEA e aumentar a eficácia do revestimento. Limpe a plasma pelo menos uma vez a cada 4-5 ciclos de ciclos de limpeza de chapas MEA.
    1. Como alternativa, quando a limpeza do plasma não for viável ou não for justificada, adicione um volume suficiente de meio contendo soro fetal bovino (FBS) para cobrir a superfície das placas MEA e devolva-as à incubadora durante a noite.
24. Use revestimento PLO (poliornitina) / Laminina. Adicionar a solução de PLO (100 μg em PBS) imediatamente após a limpeza por plasma ou aspiração e enxaguar o meio contendo FBS.
25. Plaquear as células como acima nas seguintes densidades: 1 x 10⁵ astrócitos humanos pluripotentes derivados de células-tronco (hiPSC-A) / placa e 5 x 10⁵ neurônios motores derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-MN) / placa.

2. Gravação de matriz de vários eletrodos

1. Extraia o volume brutotage dados em um 12.5 kHz sampfrequência, usando um filtro Butterworth com um filtro passa-alta de 200 Hz e filtro passa-baixo de 3 kHz. Defina o reconhecimento de pico como pontos de tempo instantâneos de tensões ≥6 desvios padrão da linha de base. Identifique intermitências como uma atividade com >5 picos em 100 ms. Defina a atividade da rede quando mais de 35% do total de eletrodos ativos disparam em 100 ms com um mínimo de 50 picos por intermitência de rede.
2. Comece a gravar o mais rápido possível após o Dia 1.
   nota: A atividade elétrica raramente será observada antes do Dia 3 do CC.
3. Culturas paralelas em placas com densidades semelhantes e réplicas nas placas de cultura ou lamínulas apropriadas para ensaios bioquímicos, imunocitoquímica (ICC) ou PCR quantitativo (qPCR).
4. Realize gravações com a temperatura ajustada para 37 °C e CO₂ a 5%. Transfira as placas para a máquina e deixe-as equilibrar por pelo menos 5 minutos antes da gravação.
5. Registre a atividade da linha de base em dias alternados ou semanalmente, durante 1 a 15 minutos, dependendo do projeto experimental. Não grave por pelo menos 1 h após uma troca de mídia e, idealmente, aguarde 24 h após cada troca de mídia.
6. Para evitar contaminação, troque o meio (ou seja, troca de meio meio meio como na etapa 1.14) após qualquer gravação em que a tampa da placa estéril tenha que ser aberta fora do capô estéril (ou seja, a aplicação de compostos de medicamentos). Realize trocas e lavagens completas do meio para lavar os medicamentos se as placas continuarem a ser usadas além do tratamento medicamentoso.
7. Para fins de análise, use pelo menos três réplicas técnicas e biológicas para cada condição. Expresse dados eletrofisiológicos como meio de n ≥ 3 repetições.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura estéreis de 10 cm	falcão	353003
25 cm2 frascos de cultura estéreis	falcão	353136
500 mL 0,2 μm CA Sistema de Filtro	Corning	430769
Pipeta de 5 mL	falcão	357543
6 placas de cultura estéreis de poço	falcão	3046
Placas Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	áxion	OPT-24
Plataforma Axion Edge MEA	áxion	Borda do Maestro
Matriz de membrana basal - Matrigel	Corning	354277	Detalhes no protocolo
Microscópio de bancada (estéril sob a capa de cultura de células)	Zeiss	Rolamento 415510-1100-000	Primo Vert
Fator neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolva 100 μg em 1 mL de PBS estéril e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Tanques e regulador de CO2 para Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	Thermofisher	Rolamento 113300	Concentração de trabalho 1x
Suplemento Essencial 8 Médio + Essencial 8	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL de suplemento Essential 8 (10x) com 500 mL de meio de crescimento Essential 8 (1x)
Soro fetal bovino (FBS)	Thermofisher	16140071	Concentração de trabalho 1x
Hemocitômetro	Ciências da Microscopia Eleitoral	Nº 63510-20
Incubadora de cultura celular com umidade controlada	ThermoFisher	370	regulado para 37 °C, 5 % de CO2
Laminina	Thermofisher	Rolamento 23017-015	Solução de estoque 1 mg/mL, concentração de trabalho 10 μg/mL (revestimento), 1 μg/mL (meio celular)
L-Glutamina	Thermofisher	25030	Dissolva 2 mg de LDN em 500 μL de clorofórmio para obter 10 mM de estoque. Aliquotar e congelar a -80 ° C. Para usar, dilua o estoque de 1 a 10 em DMSO [para 1 mM] primeiro, depois dilua 1:5000 de 1 mM na mídia desejada para obter uma solução de trabalho de 0,2 μM
Placas de vidro MEA	Sistemas Multicanal	60MEA200/30iR-Ti-gr	Concentração de trabalho 100x
Pipeta Multicanal P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentração de trabalho 1x
Pencillin/estreptomicina	Thermofisher	15140122	Concentração de trabalho 100x
Poliornitina (OLP)	Sigma-Aldrich	Pág. 3655	Concentração de trabalho 100x
Cloreto de potássio (KCl)	NA	NA	Dissolva 100 mg em 1 mL de ddW para obter 100 mg / mL de solução estoque. Alíquota do estoque em tubos de 100 μL. (concentração de trabalho 100 μg/mL)
Purmorlamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Concentração de trabalho100 mM
Inibidor de ROCK	Peprotech	1293823	Centrifugue brevemente antes da reconstituição. Dissolva 100 μg em 1 mL de PBS a 100 μg/mL e, em seguida, adicione 9 mL de BSA-PBS estéril a 0,1% a 10 μg/mL. Alíquota e congelar a -80 ° C. Diluir a 1: 1000 para utilização. (concentração de trabalho 10 ng/mL).
Capuzes de cultura de células estéreis	Companhia de Padeiros	SG-600	Dissolver 5 mg em 1480 μL de dH2O para obter 10 mM de estoque, alíquota e congelar a -80 ºC. Diluir a 1:500 para uso. (concentração de trabalho 20 μM).
Suplemento B - Suplemento B27	Thermofisher	21985023
Centrífuga de cultura de células de mesa	ThermoFisher	75004261	Concentração de trabalho 50x
Filme termoplástico - Parafilm	PARAFILME	Pág. 7793	Lenda de Sorvall X1R
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermofisher	2530054	Concentração de trabalho 1x
Banho-maria	ThermoFisher	2332	Isotemp