1. Co-cultura de astrócitos MN e da medula espinhal em placas de matriz de múltiplos eletrodos
- Diferenciar e plaquear os neurônios motores e astrócitos quando estiverem prontos para serem usados no mesmo dia e envelhecidos no dia in vitro (DIV) 60 para os neurônios motores e DIV 90 para os astrócitos.
- Cubra as placas MEA no dia anterior ou no dia do revestimento da seguinte forma se estiver trabalhando com placas plásticas de 24 poços (Tabela de Materiais).
- Dilua a poliornitina (OLP) em água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 100 μg/mL.
- Adicione 15-20 μL a cada poço (dependendo do nível de conforto da pipeta), formando uma gota no centro do poço cobrindo a área dos eletrodos e a área circundante, mas não a totalidade do poço.
- Tome cuidado para não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Seja consistente com o volume de poço a poço para garantir a cobertura da mesma área de superfície em cada poço.
- Incubar o PLO a 37 °C por um mínimo de 1 h (de preferência 2 h).
nota: Os pequenos volumes secarão se não houver umidade suficiente nas placas. Adicione água aos compartimentos ao redor dos poços para garantir umidade suficiente durante todo o processo de revestimento e gravações.
- Aspire o máximo de PLO possível usando uma ponta de micropipeta de plástico. Tome cuidado para não tocar nos eletrodos. Lave com 250 μL de água três vezes. Se estiver usando um aspirador a vácuo para lavagens, não permita que a ponta se aproxime do feixe de eletrodos. Após a terceira lavagem, remova o máximo de água possível, usando uma ponta de pipeta conforme necessário. Deixe a superfície secar sob a capa de cultura de células com a tampa removida.
- Quando as superfícies das placas estiverem secas, adicione laminina diluída a 10 μg/mL em PBS. Use 15-20 μL para cobrir cada feixe de eletrodos. Adicione água aos compartimentos de umidade, recoloque a tampa e retorne a placa à incubação a 37 ° C por um mínimo de 2 h até a noite.
- No dia do plaqueamento, enxágue as culturas de neurônios motores (MN) e astrócitos uma vez com PBS e adicione tripsina 0,05% a 37 ° C para levantar as células (5 min). Colete em um tubo cônico de 15 mL contendo inibidor de tripsina e lave as placas com meio ou base para garantir que todas as células sejam coletadas. Centrifugue a 300 x g por 5 min e ressuspenda com uma pipeta de 1000 μL para gerar 1 mL de uma única suspensão celular. Ao ressuspender MN e astrócitos, mude para o meio de co-cultura (Tabela 1), com a adição de 20 μM de inibidor da proteína serina/treonina quinase formadora de bobina enrolada associada a Rho (ROCK-I).
- Conte o MN e os astrócitos em paralelo usando um hemocitômetro. Enquanto conta e faz cálculos, tampe as suspensões das células e coloque-as em um rack de isopor a 4 °C.
- Calcule o volume necessário para ressuspender as culturas a uma concentração de 5 x 104 células por 5 μL para neurônios motores e 2,5 x 104 células por 5 μL para astrócitos. Centrifugue as suspensões de células de 1 mL a 300 x g por 5 min e ressuspenda no volume calculado.
- Calcule o número de poços desejados a serem semeados e multiplique por 5 μL de cada suspensão celular. Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos na proporção de 1:1 e misture pipetando até que estejam completamente combinados (geralmente duas vezes), mas evite ser muito agressivo.
- Remova a laminina de cada poço da placa MEA usando uma ponta de pipeta. Transfira 10 μL da suspensão celular combinada final para cada poço, formando uma pequena gotícula cobrindo o feixe de eletrodos para fornecer uma densidade celular de 5 x 104 MN e 2,5 x 104 astrócitos por poço.
nota: A alta densidade celular na suspensão combinada requer ressuspensão frequente entre os poços durante a etapa de semeadura para garantir contagens de células precisas e consistentes.
- Retorne as placas para a incubadora por 20-30 min. Tome cuidado para não perturbar a gotícula celular e permitir que as células formem ligações iniciais nas placas.
- Após 20-30 min, adicione meios de co-cultura quentes + ROCK-I a cada poço pipetando 250 μL na parede de cada poço, seguido por 250 μL adicionais na parede do mesmo poço no lado oposto. Retorne a placa para a incubadora.
- Examine as placas no dia seguinte à semeadura (Co-cultura Dia 1). Se houver detritos celulares significativos ou células mortas, troque o meio por um meio de co-cultura fresco contendo ROCK-I. Caso contrário, mude o meio no segundo dia após a semeadura (Co-Cultura Dia 2) para o meio de co-cultura sem ROCK-I. Realizar trocas de meio meio (aspirar 50% e adicionar 60% do volume final para contabilizar a evaporação) duas vezes por semana.
- Se estiver usando sistemas MEA com placas de vidro de 30 mm de poço único (Tabela de Materiais), a preparação da placa pode levar 2 ou mais dias. Siga as etapas abaixo para fazer isso.
- Levante as células e detritos celulares das culturas MEA anteriores com 0,05% de tripsina por 5-15 min.
- Aspire a tripsina e enxágue três vezes com água.
- Esterilize adicionando etanol a 70% e incube no exaustor por 10 min. Aspire o etanol e depois enxágue com água três vezes.
- Aplique detergente aniônico a 1% com enzima protease em água. Cubra os pratos com uma tampa e embrulhe com filme termoplástico e papel alumínio e, em seguida, deixe-os em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente durante a noite.
- Aspire o detergente e depois enxágue três vezes com água.
- Se estiver planejando armazenar as placas, adicione um volume suficiente de água. Cubra os pratos com uma tampa e embrulhe-os com filme termoplástico e papel alumínio e deixe-os na geladeira até o próximo uso.
- Se estiver planejando revestir, deixe a superfície secar sob a capa de cultura de células.
- Se for necessária esterilização extra (por exemplo, infecção anterior ou uso não recente), somente neste ponto, exponha as placas MEA à luz ultravioleta (UV) sob o capô por 30-60 min.
nota: Evitar a luz UV frequente evitará danos aos eletrodos. O uso de luz ultravioleta quando as placas contêm soro resultará em eletrodos não funcionais, razão pela qual ela só deve ser usada em placas limpas.
- Quando as placas estiverem completamente secas, prossiga com a limpeza a plasma por 1 minuto para carregar a superfície de vidro das placas MEA e aumentar a eficácia do revestimento. Limpe a plasma pelo menos uma vez a cada 4-5 ciclos de ciclos de limpeza de chapas MEA.
- Como alternativa, quando a limpeza do plasma não for viável ou não for justificada, adicione um volume suficiente de meio contendo soro fetal bovino (FBS) para cobrir a superfície das placas MEA e devolva-as à incubadora durante a noite.
- Use revestimento PLO (poliornitina) / Laminina. Adicionar a solução de PLO (100 μg em PBS) imediatamente após a limpeza por plasma ou aspiração e enxaguar o meio contendo FBS.
- Plaquear as células como acima nas seguintes densidades: 1 x 105 astrócitos humanos pluripotentes derivados de células-tronco (hiPSC-A) / placa e 5 x 105 neurônios motores derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-MN) / placa.
2. Gravação de matriz de vários eletrodos
- Extraia o volume brutotage dados em um 12.5 kHz sampfrequência, usando um filtro Butterworth com um filtro passa-alta de 200 Hz e filtro passa-baixo de 3 kHz. Defina o reconhecimento de pico como pontos de tempo instantâneos de tensões ≥6 desvios padrão da linha de base. Identifique intermitências como uma atividade com >5 picos em 100 ms. Defina a atividade da rede quando mais de 35% do total de eletrodos ativos disparam em 100 ms com um mínimo de 50 picos por intermitência de rede.
- Comece a gravar o mais rápido possível após o Dia 1.
nota: A atividade elétrica raramente será observada antes do Dia 3 do CC.
- Culturas paralelas em placas com densidades semelhantes e réplicas nas placas de cultura ou lamínulas apropriadas para ensaios bioquímicos, imunocitoquímica (ICC) ou PCR quantitativo (qPCR).
- Realize gravações com a temperatura ajustada para 37 °C e CO2 a 5%. Transfira as placas para a máquina e deixe-as equilibrar por pelo menos 5 minutos antes da gravação.
- Registre a atividade da linha de base em dias alternados ou semanalmente, durante 1 a 15 minutos, dependendo do projeto experimental. Não grave por pelo menos 1 h após uma troca de mídia e, idealmente, aguarde 24 h após cada troca de mídia.
- Para evitar contaminação, troque o meio (ou seja, troca de meio meio meio como na etapa 1.14) após qualquer gravação em que a tampa da placa estéril tenha que ser aberta fora do capô estéril (ou seja, a aplicação de compostos de medicamentos). Realize trocas e lavagens completas do meio para lavar os medicamentos se as placas continuarem a ser usadas além do tratamento medicamentoso.
- Para fins de análise, use pelo menos três réplicas técnicas e biológicas para cada condição. Expresse dados eletrofisiológicos como meio de n ≥ 3 repetições.
