Medição simultânea do cálcio intracelular e do potencial de membrana em um endotélio cerebral de camundongo

Resumo

Fonte: Hakim, M. A. et al. Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana em endotélio cerebral de camundongo recém-isolado e intacto. J. Vis. Exp. (2019)

O vídeo demonstra a medição simultânea dos níveis de cálcio intracelular e alterações no potencial de membrana em células endoteliais de segmentos de artéria cerebral de camundongos. O tubo endotelial isolado é carregado com um indicador fluorescente de cálcio e tratado com um medicamento que induz a liberação intracelular de cálcio, resultando em uma alteração no potencial de membrana. A fluorescência do indicador permite a medição dos níveis de cálcio e um eletrodo de registro é inserido em uma célula para medir as mudanças no potencial de membrana.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Dissecção e Isolamento da Artéria Cerebral

NOTA: Todos os procedimentos de dissecção requerem ampliação da amostra (até 50x) por meio de estereomicroscópios e iluminação fornecida por fontes de luz de fibra óptica. Para realizar procedimentos de dissecção para isolamento do cérebro e artérias, use instrumentos de dissecção afiados. As ferramentas de microdissecção para isolar e limpar artérias incluem pinças afiadas de ponta fina e tesouras de dissecção estilo Vannas (lâminas de 3 a 9,5 mm).

1. Isolamento do cérebro do rato
   1. Anestesiar um camundongo C57BL/6 (3-30 meses de idade; macho ou fêmea) por inalação de isoflurano (3% por 2–3 min) e, em seguida, decapitar o animal imediatamente após a indução completa da anestesia. Colocar a cabeça numa placa de Petri (diâmetro 10 cm, profundidade 1,5 cm) contendo solução salina fisiológica (PSS) zero Ca²⁺ fria (4 °C) sob um estereomicroscópio.
   2. Visualizando através do microscópio, remova a pele e o cabelo sobre o crânio e remova o excesso de sangue com frio zero Ca²⁺ PSS. Faça uma incisão usando apenas as pontas de uma tesoura de dissecção padrão (por exemplo, lâmina de 24 mm), começando com o osso occipital e estendendo-se até o osso nasal do crânio.
   3. Abra o crânio cuidadosamente ao longo da incisão usando uma pinça de ponta grossa e separe o tecido conjuntivo para isolar o cérebro com um Círculo de Willis.
      intacto NOTA: Alternativamente, a pinça de corte ósseo Littauer pode ser usada para abrir o crânio e expor o cérebro.
   4. Lave suavemente o cérebro isolado com zero frio Ca²⁺ PSS em um béquer para remover o sangue. Coloque o lado ventral do cérebro voltado para cima em uma câmara contendo solução de dissecção fria para isolamento das artérias cerebrais (Figura 1A).
2. Isolamento das Artérias Cerebrais
   NOTA: A artéria cerebral posterior foi selecionada como um modelo de estudo endotelial cerebrovascular representativo para este protocolo.
   1. Prenda o cérebro isolado em solução de dissecção a frio usando pinos de aço inoxidável (diâmetro 0.2 mm, comprimento ~ 11–12 mm) para ser inserido em um polímero de silício com infusão de carvão que reveste o fundo (profundidade ≥50 cm) de uma placa de Petri de vidro.
   2. Para manter uma temperatura resfriada de PSS durante a dissecação, use uma câmara de dissecação resfriada por um sistema refrigerante que alterna continuamente uma mistura de água-etilenoglicol 1:1. Alternativamente, a dissecção pode ser realizada em gelo fresco.
   3. Isolar cirurgicamente as artérias cerebrais posteriores (~ 0,3 a 0,5 cm, segmentos sem tensão axial) das artérias comunicantes posteriores e basilares usando instrumentos de microdissecção, tesoura estilo Vannas e pinça afiada de ponta fina (Figura 1B). Use pinos de aço inoxidável (diâmetro 0,1 mm, comprimento ~ 13–14 mm) para prender ambas as artérias cerebrais posteriores isoladas na solução de dissecção na placa de Petri (Figura 1C).
   4. Limpe cuidadosamente as artérias cerebrais posteriores isoladas, removendo o tecido conjuntivo usando pinças afiadas de ponta fina (Figura 1D). Corte as artérias intactas em segmentos (comprimento de 1 a 2 mm) para digestão enzimática (Figura 1D; inserção).

2. Preparação do tubo endotelial e superfusão

1. Prepare o aparelho de trituração usando um microscópio equipado com objetivas (10x, 20x e 40x), uma câmera e uma platina de alumínio contendo uma câmara e micromanipuladores. Prenda uma microsseringa com um controlador de bomba adjacente ao stage e amostra (Figura 2A).
2. Encha completamente uma pipeta de trituração com óleo mineral e prenda-a sobre o pistão da microseringa. Em seguida, usando a microseringa com controlador de bomba, retire a solução de dissociação para a pipeta (~130 nl) em cima do óleo mineral, garantindo a ausência de bolhas de ar na pipeta.
3. Coloque os segmentos arteriais intactos em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL (Figura 2B), contendo 0,31 mg/mL de papaína, 0,5 mg/mL de ditioeritritol, 0,75 mg/mL de colagenase e 0,13 mg/mL de elastase. Incubar a 34 °C durante 10-12 min para uma digestão parcial.
4. Após a digestão, substitua a solução enzimática por ~ 5 mL de solução de dissociação fresca. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira um segmento para uma câmara contendo a solução de dissociação à temperatura ambiente (RT).
5. Colocar a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicioná-la perto de uma extremidade do recipiente digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 2 a 5 nL/s no controlador da bomba para uma trituração suave (Figura 2C; inserção).
6. Enquanto visualiza através de uma ampliação de 100x a 200x, retire e ejete o segmento arterial para dissociar as células musculares lisas enquanto produz um tubo endotelial. Se necessário, use cuidadosamente uma pinça de ponta fina para separar a adventícia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Confirme se todas as células musculares lisas estão dissociadas e que apenas as células endoteliais permanecem como um "tubo" intacto (Figura 2C).
7. Usando micromanipuladores, prenda cada extremidade do tubo endotelial na lamínula de vidro da câmara de superfusão usando pipetas de fixação de vidro borossilicato (Figura 2D).
8. Lave a adventícia dissociada e as células musculares lisas da câmara e substitua a solução de dissociação por 2 mM CaCl₂ PSS. Transfira a plataforma móvel com tubo endotelial seguro para o microscópio de superfusão e equipamento experimental.
9. Use 6 reservatórios limpos de 50 mL (Figura 3A) para entrega contínua de PSS e respectivas soluções medicamentosas durante o experimento, conforme apropriado. Use a válvula de controle de fluxo em linha para definir manualmente a taxa de fluxo de acordo com o fluxo laminar, combinando a alimentação de fluxo com a sucção a vácuo. Entregue PSS à câmara (Figura 3B) para a superfusão do tubo endotelial por ≥ 5 min antes de registrar os dados de fundo e o carregamento do corante.

3. Carga de corante, lavagem e configurações de temperatura

1. Ligue todos os componentes do sistema de fotometria para medir [Ca²⁺]_i. Use o microscópio no equipamento experimental (Figura 3C) para visualizar o tubo endotelial com ampliação de 400x e concentre-se nas células na janela fotométrica usando o pacote de software do sistema de fotometria.
2. Meça o diâmetro do tubo endotelial e registre os valores de autofluorescência de fundo de acordo com a emissão de 510 nm durante a excitação alternada a 340 e 380 nm (≥10 Hz).
3. Para medir as respostas intracelulares de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), carregue o tubo endotelial com corante Fura-2 AM (éster Fura-2-acetoximetílico, concentração final de 10 μM) em RT e aguarde ~ 30–40 min na ausência de luz.
4. Reinicie a superfusão do tubo endotelial com PSS fresco por ~ 30–40 min para lavar o excesso de corante e permitir que o Fura-2 AM intracelular se desesterifique. Durante o período de lavagem, aumentar gradualmente a temperatura de RT para 37 °C usando o controlador de temperatura (Figura 3A) com um aquecedor em linha e, em seguida, manter a 37 °C durante todo o experimento.
   nota: A transição incremental recomendada entre RT e 37 °C envolve três etapas (por exemplo, 5 °C) com um tempo de equilíbrio de ≥5 min em cada etapa.

4. Medição simultânea de [Ca²⁺]_i e V_m

1. Ligue todos os outros equipamentos e o pacote de software do eletrômetro para medir o potencial da membrana (V_m, consulte a Figura 3, Figura 4). Ajuste a taxa de aquisição de dados de acordo (≥10 Hz).
2. Puxe um eletrodo afiado e preencha com 2 M KCl. Para estudos de acoplamento intercelular via transferência de corante, preencha os microeletrodos com iodeto de propídio a 0,1% dissolvido em 2 M KCl.
3. Prenda o eletrodo sobre um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas preso a um cabeçote de eletrômetro preso com um micromanipulador. Use o micromanipulador para posicionar brevemente a ponta do eletrodo no PSS que flui na câmara enquanto visualiza através da objetiva 4x.
4. Defina o V_m em repouso como 0 como consistente com o potencial de banho aterrado. Posicione a ponta do eletrodo logo acima de uma célula do tubo endotelial. Se desejar, use monitores de linha de base audíveis vinculados a eletrômetros para associar o tom do som a possíveis gravações.
5. Aumente a ampliação para 400x usando a objetiva de 40x e reposicione a ponta do eletrodo conforme necessário. Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para focar em ~ 50 a 80 células endoteliais.
6. Coloque suavemente o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e aguarde ≥2 min para que o V_m em repouso se estabilize. Da mesma forma, insira um segundo eletrodo em outra célula (distância ≥100 μm) da primeira célula empalada com o primeiro eletrodo.
7. Uma vez que V_m em repouso esteja estável em seus valores esperados (-30 a -40 mV), ligue o PMT na interface de fluorescência na ausência de luz e inicie a aquisição de [Ca²⁺]_i intracelular excitando Fura-2 alternadamente (10 Hz) a 340 e 380 nm enquanto coleta a emissão de fluorescência a 510 nm.
   NOTA: Para testar o acoplamento elétrico intercelular, a corrente (± 0.5-3 nA, ~ 20 s de duração do pulso) pode ser fornecida por meio de um eletrômetro como "Local 1", e as alterações de V_m podem ser registradas com outro eletrômetro como "Local 2" (distância ≥100 μm).
8. Uma vez estabelecidas as medições simultâneas de V_m e [Ca²⁺]_i, aguarde ~5 min para superfusão do tubo endotelial com PSS a uma taxa de fluxo laminar constante antes da aplicação dos medicamentos.
9. Aplique o medicamento (por exemplo, trifosfato de adenosina [ATP]) preparado em PSS na câmara de superfusão com a taxa de fluxo constante. Após ~ 3 min (ou um período de tempo apropriado para a cinética do medicamento), lave com PSS até_{V m} e a proporção F₃₄₀ / F₃₈₀ retorne às suas condições basais. Marque as respectivas gravações como sincronizadas temporariamente entre os pacotes de software de fotômetro e eletrômetro durante cada transição de soluções.
10. Uma vez feito o experimento, retire o eletrodo da célula usando o micromanipulador e observe V_m ~ 0 mV conforme referenciado pelo eletrodo de banho. Pare as respectivas gravações de V_m e [Ca²⁺]_i e salve os registros em file para análise de dados.

Resultados

Figura 1: Isolamento da artéria cerebral do cérebro. (A) Cérebro isolado com artérias intactas (seta branca indica a artéria cerebral posterior) em solução de dissecção. (B) Vista ampliada da artéria cerebral posterior (seta branca; ~ 3x vs.Painel A). (C) Artérias cerebrais posteriores isoladas protegidas com pinos de aço inoxidável em prato...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
glicose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)	G7021
NaCl	sigma	S7653
MgCl2	sigma	M2670
CaCl2	sigma	223506
HEPES	sigma	H4034
Kcl	sigma	Pág. 9541
NaOH	sigma	S8045
ATP	sigma	Resposta A2383
Hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)	A466250
Colagenase (Mistura Tipo H)	sigma	C8051
Ditioeritritol	sigma	D8255
papaína	sigma	Pág. 4762
Elastásio	sigma	E7885
Bsa	sigma	Rolamento A7906
Iodeto de propídio	sigma	Pág. 4170
Dmso	sigma	D8418
Corante Fura-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA	F14185
Chiller de recirculação (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Câmara de superfusão de plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, EUA	RC-27
Fundo em lamínula de vidro (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Plataforma de alumínio anodizado (diâmetro: 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 ou PH6
Platina compacta de alumínio	Siskiyou, Grants Pass, OR, EUA	8090P
Micromanipulador	Siskiyou	MX10
Estereomicroscópios	Zeiss, NY, EUA	Stemi 2000 & 2000-C
Fontes de luz de fibra óptica	Schott, Mainz, Alemanha & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Microscópio invertido Nikon	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EUA	Ts2
Objetivas de contraste de fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Objetivas fluorescentes	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Microscópio invertido Nikon	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Controlador de bomba de microsseringa (Micro4)	Instrumentos de precisão do mundo (WPI), Sarasota, FL, EUA	SYS-MICRO4
Tabela de isolamento de vibração	Fabricação Técnica, Peabody, MA, EUA	Micro-g
Amplificadores	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA, EUA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Dispositivos Moleculares	HS-2A e HS-9A
Gerador de funções	EZ Digital, Seul, Coreia do Sul	Rolamento FG-8002
Sistema de aquisição de dados	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA, EUA	Digidata 1550A
Monitores de linha de base audíveis	Ampol US LLC, Sarasota, FL, EUA	BM-A-TM
Osciloscópio de armazenamento digital	Tektronix, Beaverton, Oregon, EUA	TDS 2024B
Interface do sistema de fluorescência, lâmpada ARC + fonte de alimentação, Hyperswitch, PMT	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA, EUA	Sistemas IonOptix
Controlador de temperatura	Warner Instruments	TC-344B ou C
Aquecedor em linha	Warner Instruments	SH-27B
Controlador de válvula	Warner Instruments	VC-6
Válvula de controle de fluxo em linha	Warner Instruments	FR-50
Extrator Eletrônico	Instrumentos Sutter, Novato, CA, EUA	P-97 ou P-1000
Microforja	Narishige, East Meadow, NY, EUA	MF-900
Tubos de vidro borossilicato (trituração)	Instrumentos de precisão do mundo (WPI), Sarasota, FL, EUA	1B100-4
Tubos de vidro borossilicato (pinagem)	Warner Instruments	G150T-6
Tubos de vidro borossilicato (eletrodos afiados)	Warner Instruments	GC100F-10
Filtro de seringa (0,22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Placa de Petri de Vidro + Carvão Sylgard	Instrumentação de Sistemas Vivos, St. Albans City, VT, EUA	DD-90-S-BLK
Tesoura Estilo Vannas (3 mm & 9.5 mm)	Instrumentos de precisão mundiais	555640S, 14364
Tesouras 3 & 7 mm lâminas	Ferramentas de Belas Ciências (ou FST), Foster City, CA, EUA	Moria MC52 & 15000-00
Pinça afiada de ponta fina	Festa	Dumont #5 & Dumont #55