Artigo de método

Avaliando a formação de conexões neurais em uma co-cultura usando registros eletrofisiológicos

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Su, C. T. E., et al. Uma abordagem optogenética para avaliar a formação de conexões neuronais em um sistema de co-cultura. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra a gravação eletrofisiológica para avaliar as conexões neurais entre neurônios corticais derivados de iPSC e de ratos, confirmando contatos sinápticos na co-cultura, ativando canais iônicos sensíveis à luz e detectando correntes pós-sinápticas.

Protocolo

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1. Registros eletrofisiológicos de neurônios derivados de iPSC

  1. Confirme se as iPSCs humanas se comportam como neurônios maduros.
    1. Encontre células diferenciadas de iPSCs humanas pela visualização de tdTomato usando um microscópio confocal vertical equipado com uma lente de imersão em água de 60X (0,9 NA).
    2. Puxe a pipeta de registro para uma resistência de 4 a 6 M. Perfundir células à temperatura ambiente em uma solução externa borbulhando constantemente com 95% O2/ 5% CO2. Encha a micropipeta de gravação com a solução interna.
    3. Patch tdTomato+ célula no modo de célula inteira e registre o disparo do potencial de ação em resposta à injeção de corrente (duração de 1 segundo, incrementos de 10 pA) no grampo de corrente.
  2. Confirme se o potencial de ação das células corticais que expressam ChR2 é evocado de forma confiável pela estimulação da luz.
    1. Encontre células corticais expressando ChR2 pela visualização de GFP sob um microscópio confocal. Execute o registro do patch clamp de célula inteira nas células corticais seguindo as etapas 1.1.2 a 1.1.3.
    2. Verifique se o potencial de ação é evocado de forma confiável pela iluminação da luz com uma lâmpada de arco de mercúrio (100 W). O comprimento de onda do filtro de excitação é de 480/40 nm.
  3. Realize estimulação optogenética.
    1. Patch tdTomate + célula no modo de célula inteira e defina o grampo de tensão em -70mV. Filtre os sinais de corrente em 2 kHz e digitalize em 10 kHz. Monitore resistências em série variando de 10 a 20 M para consistência durante as gravações.
    2. Estimule todo o campo com lâmpada de mercúrio de 100 W com um filtro de excitação de 480/40 nm por 30 segundos.
    3. Registre as correntes pós-sinápticas (PSCs) de células remendadas induzidas por fotoestimulação de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2. Detecte e meça PSCs.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NaClsigmaS7653
KclsigmaPág. 5405
NaHCO3sigmaS5761
NaH2PO4FlukaRolamento 71505
MgCl2sigmaM8266
CaCl2sigmaC1016
D(+)-glicosesigmaG7520Para estudos eletrofisiológicos
K-gluconatosigmaPág. 1847
KohKANTO QuímicaRolamento 3234400
HEPESsigmaH3375Para estudos eletrofisiológicos
EGTAsigmaE3889
Na2ATPsigmaRolamento A7699
Na3GTPsigmaG8877
Capilares de vidro borossilicatoInstrumentos de precisão do mundo, Inc1604323
Lâmpada de arco curto de mercúrioOSRAMHBO 103 W/2

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Etiquetas

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