Imagem da sinalização de cálcio induzida por nicotina ao longo dos axônios do hipocampo ventral em co-culturas sinápticas

Resumo

Fonte: Zhong, C., et al., Imagens ao vivo da sinalização de cálcio induzida por nicotina e liberação de neurotransmissores ao longo dos axônios do hipocampo ventral. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra como a ativação mediada pela nicotina dos receptores nicotínicos de acetilcolina no hipocampo ventral do camundongo resulta em sinalização sustentada de cálcio ao longo dos axônios.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imagem de cálcio

1. Enxágue as culturas (5 a 7 dias in vitro) rapidamente com HBS normal e, em seguida, carregue as culturas com 5 μM do indicador Fluo-4 Ca²⁺ (éster AM) e 0,02% de Pluronic F-127 em HBS (2 ml) por 30 min a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. Lave a solução de Fluo-4 com HBS (3 vezes/5 min). Retorne as culturas à incubadora (37 °C / 5% CO₂) por pelo menos 30 min.
3. Mantenha as culturas (5 a 7 dias in vitro) em uma câmara de imagem e monte a câmara em um microscópio confocal de disco giratório. Perfundir continuamente (1 ml/min) com coquetel HBS em RT.
4. Colete imagens de fluorescência Fluo-4 de projeções axonais das microfatias vHipp com uma objetiva Plan-Apochromat (água 60X com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e uma câmera CCD.
5. Colete imagens de fluorescência Fluo-4 basais (a cada 10 segundos por 2 min) como um controle pré-nicotina. Aplique nicotina (1 μM) por perfusão rápida (2 ml/min) por 1 min e, em seguida, lave a nicotina com um coquetel HBS. Continue capturando imagens de lapso de tempo antes, durante e após a aplicação de nicotina a cada 10 segundos por 30 minutos.
6. Salve todos os quadros das imagens brutas de fluorescência fluo-4 e exporte-os como uma série de imagens TIFF para análise posterior.
7. Colete a intensidade integrada da fluorescência fluo-4 ao longo dos axônios vHipp antes e depois da aplicação de nicotina.
8. Normalize a intensidade de fluorescência integrada com a seguinte equação: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, onde F₀ é a intensidade de fluorescência integrada pré-nicotina corrigida pelo fundo e F é a intensidade de fluorescência integrada ao longo dos axônios vHipp em cada ponto de tempo após a aplicação de nicotina. Analise e plote a intensidade de fluorescência integrada normalizada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coquetel HBS para imagens ao vivo pH = 7,3
NaCl	sigma	S9888	135 mM
Kcl	sigma	Pág. 9333	5 mM
Cloreto de magnésio	sigma	M8266	1 mM
Cloreto de cálcio	sigma	C1016	2 mM
HEPES	sigma	H3375	10 mM
glicose	sigma	G0350500	10 mM
Tetrodotoxina	Tocris	1078	2 μM
Bicuculina	Tocris	131	10 μM
D-AP-5	Tocris	105	50 μM
CNQX	Tocris	1045	20 μM
LY341495	Tocris	1209	10 μM