Testando a função nervosa sensorial em um modelo de camundongo desnervado cirurgicamente

Abstract

Fonte: Peterson, S. C. et al., Denervação Cirúrgica Cutânea: Um Método para Testar a Necessidade de Nervos em Modelos de Doenças de Pele em Camundongos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o teste da função nervosa sensorial em um modelo de camundongo, desnervando cirurgicamente um lado e deixando o outro como controle. A resposta à estimulação mecânica confirma o papel dos nervos sensoriais.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Denervação Cirúrgica

1. Injete a solução anestésica por via intraperitoneal na dose de 200 μl por 20 g de peso corporal do camundongo. Verifique se o animal atingiu o plano adequado de sedação pelo ensaio de pinça do dedo do pé e confirme se as frequências cardíaca e respiratória estão normais (aproximadamente 600 batimentos e 160 respirações por minuto, respectivamente).
2. Prepare a área cirúrgica da pele posterior com Betadine e lenços umedecidos com álcool e cubra o animal com um campo cirúrgico estéril (para fins de demonstração, o campo estéril foi omitido para aumentar a visibilidade). Mantenha o animal aquecido usando uma almofada de aquecimento durante a operação em uma área cirúrgica asséptica.
3. Faça uma incisão usando um bisturi # 11 estéril ao longo da linha média dorsal da base do pescoço até cerca de 0,5 cm acima da cauda.
4. Usando uma pinça romba, reflita suavemente a pele do lado esquerdo, longe do flanco, para visualizar o tecido subjacente das bolsas de gordura escapular perto do pescoço até logo acima do membro posterior.
   nota: Os nervos cutâneos dorsais aparecem como fios brancos que viajam caudalmente através da fáscia translúcida da parede do tronco antes de fazer curvas acentuadas e entrar no tecido conjuntivo frouxo sob a pele (Figura 1).
5. Usando uma pinça ultrafina sob um microscópio óptico de dissecação, remova os nervos exclusivamente do lado esquerdo do animal localizado nos sítios anatômicos T3-12, arrancando de onde os segmentos se dobram na parede do tronco até seus locais de entrada na pele (Figura 1).
   1. Oriente a pinça verticalmente e remove os nervos segurando aproximadamente 0,5 cm abaixo de seus locais de curvatura e puxando para cima, fazendo com que o nervo se estique e se separe do tecido circundante (Figura 1C-E). Tenha cuidado para evitar romper os vasos sanguíneos adjacentes.
   2. Continue até que todos os nervos que se estendem da parede do tronco até a pele sejam removidos. Não perturbe os nervos dentro da fáscia densa da parede do tronco. Mantenha o tecido úmido durante todo o procedimento, aplicando periodicamente gotas de solução salina estéril a 0,9%.
   3. Como alternativa, remova os nervos segurando suas extremidades proximais perto da parede do tronco com uma pinça e cortando com uma tesoura fina. Em seguida, corte as extremidades distais próximas à pele (Figuras 1F-H). Finalmente, remova os segmentos nervosos intermediários (Figura 1I).
6. Remova todos os nervos do retalho cutâneo exposto na Etapa 1.4. Essas fibras compreendem os ramos distais dos nervos cutâneos dorsais e aparecem como fios brancos ramificados localizados esporadicamente dentro do tecido conjuntivo no lado dérmico do retalho cutâneo (Figuras 1J-K).
   1. Para remover esses ramos finos, posicione a pinça fina aproximadamente paralela à superfície dérmica, segure os nervos e puxe para cima para evitar romper os vasos sanguíneos e perfurar a pele. Continue até que todos os nervos visíveis tenham sido removidos.
7. Usando dissecção romba, reflita a pele no lado direito da incisão da linha média dorsal, mas não remova os nervos. Isso servirá como controle contralateral operado de forma simulada.
8. Sutura ao longo da linha média dorsal em um padrão simples interrompido para fechar a incisão usando pontos de náilon 6-0, em um padrão simples interrompido espaçado cerca de 3 mm.
9. Não devolva os camundongos que foram submetidos à cirurgia na mesma gaiola que outros animais até que estejam totalmente recuperados.
10. Monitore os animais imediatamente após a cirurgia até que recuperem a consciência e também diariamente até que a área cirúrgica esteja cicatrizada, geralmente dentro de 1 semana. Use analgésicos de acordo com as diretrizes institucionais designadas para cuidados com animais e use se os camundongos apresentarem sinais de dor ou angústia. Remova as suturas dentro de 7 a 10 dias após a cirurgia. nota: Se necessário, prepare a solução analgésica diluindo o carprofeno (50 mg / ml de solução-mãe) 1:100 em água estéril. Injete a solução por via subcutânea entre as omoplatas perto da nuca, na dose de 200 μl por 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal do camundongo).
11. Para avaliar funcionalmente a desnervação estável até várias semanas após a cirurgia, remova o cabelo da pele dorsal usando um aparador elétrico.
12. Pique suavemente a área da pele desnervada usando uma agulha hipodérmica e observe se o animal responde, geralmente estremecendo ou virando a cabeça. Se a área da pele tiver sido desnervada de forma estável, o animal exibirá pouca ou nenhuma resposta.

Results

Figura 1. Duas abordagens para desnervar a pele dorsal. (A) Diagrama de desenho animado da pele de camundongo inervada. Linhas pontilhadas vermelhas indicam uma única excisão feita ao longo da linha média dorsal para expor a musculatura subjacente na parede do tronco (roxo), bem como a derme (cinza, asterisco) sob a pele refletida. Os nervos cutâneos dorsais que viajam caudalmente parecem "dobrar"...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Almofadas de preparação de álcool	Pdi	B339
AnaSed (xilazina)	Lloyd	NADA 139-236
Almofadas de preparação Betadine	Medline	MDS093917
Carprofeno (Rimadyl)	Zoetis
Aparador recarregável sem fio	Wahl	aparador modelo 8900
Suturas de nylon 6-0	DemeTECH	NL166012F4P
Pinça ultrafina	Dumont	0103-5-PO