Investigando o pós-potencial despolarizante prolongado (PDA) em fotorreceptores de Drosophila

Resumo

Fonte: Gutorov, R., et al. Métodos eletrofisiológicos para medir os níveis de fotopigmento em fotorreceptores de Drosophila. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra um protocolo experimental para investigar o pós-potencial despolarizante prolongado (PDA) em Drosophila de olhos brancos. O olho da mosca é exposto a intensos pulsos de luz azul para converter o fotopigmento rodopsina em metarodopsina, iniciando uma cascata de sinalização que abre canais iônicos positivos e causa despolarização da membrana. Como a luz azul impede a reconversão da metarodopsina em rodopsina, o influxo contínuo de íons positivos resulta em despolarização sustentada, conhecida como pós-potencial despolarizante prolongado (PDA).

Protocolo

1. Medindo o pós-potencial despolarizante prolongado (PDA) usando o eletrorretinograma

1. Condições de criação adequadas para a preparação de Drosophila melanogaster
   1. Raise D. melanogaster moscas em garrafas contendo milho amarelo padrão contendo alimentos em uma incubadora mantida a uma temperatura de 24 ° C e em um ciclo escuro / claro de 12 h.
   2. Manter as garrafas de mosca no escuro pelo menos 24 horas antes da experiência.
2. Configuração geral
   1. Prepare as pipetas de registro puxando capilares de vidro borossilicato preenchidos com fibra de 1 mm x 0.58 mm (OD x DI) (Figura 1L, O). A resistência das pipetas deve ser de 5-10 MΩ; qualquer extrator adequado pode ser usado.
   2. Cubra dois fios de prata com AgCl₂, inserindo fio de prata de 0.25 mm em uma solução 3 M KCl conectada a uma fonte de alimentação de 5 V feita sob medida.
   3. Insira cada fio de prata revestido nos suportes do eletrodo (Figura 1N).
   4. Encha o capilar de vidro com solução de Ringer filtrada (ver Tabela 1) usando uma seringa de ponta alongada (Figura 1M).
   5. Insira o eletrodo de fio no capilar de vidro. Certifique-se de que a solução dentro do capilar esteja em contato com o fio de prata.
   6. Insira os suportes dos eletrodos (Figura 2P, N) nos dois micromanipuladores de eletrodos (Figura 2G).
3. Procedimento de preparação da mosca para gravações elétricas
   NOTA: Para manter a mosca em condições adaptadas ao escuro, use apenas iluminação de luz vermelha fraca durante as etapas a seguir.
   1. Anestesie as moscas na garrafa com gás CO₂ usando o sistema de dormente de mosca (Figura 1A, B) e despeje-as no recipiente dormente.
   2. Escolha uma mosca e segure-a cuidadosamente pela asa usando uma pinça afiada. Cubra o resto das moscas com uma placa de Petri.
   3. Coloque a braguilha no porta-moscas na orientação correta - deitada de lado, de costas para a mão (Figura 1P).
   4. Ligue a fonte de alimentação do ferro de solda. Defina a corrente para ~2.25 A. Esta corrente deve aquecer o filamento de platina-irídio de 0,25 mm a ~55-56 °C.
   5. Coloque uma gota de cera com baixa temperatura de fusão (~55-56 °C) no ferro de solda (Figura 1F).
   6. Usando uma pinça, levante a mosca de suas asas e fixe suas asas no porta-moscas (Figura 1I) usando o ferro de solda.
   7. Usando o ferro de solda, conecte as costas da mosca à superfície do suporte com cera (Figura 1P).
   8. Abaixe a ponta do ferro de solda no ponto de união das pernas e derreta a cera para cobrir todas as pernas juntas (Figura 1P).
   9. Coloque uma pequena gota de cera entre a cabeça e as costas na região do pescoço (Figura 1P).
      NOTA: Tome cuidado especial para evitar o superaquecimento da cabeça da mosca. Certifique-se de que a mosca esteja devidamente fixada e incapaz de se mover durante o experimento; Pequenos movimentos podem criar artefatos nas gravações. Certifique-se de que as aberturas da traqueia (entradas de respiração) no tórax e no abdômen não estejam cobertas com cera.
   10. Coloque o porta-moscas (Figura 2Q) em uma gaiola de Faraday escura em um bloco magnético (Figura 2I) e certifique-se de que a mosca esteja a ~ 5 mm da extremidade da guia de luz (Figura 2L).
   11. Coloque o eletrodo de registro (Figura 2P) acima do olho da mosca e o eletrodo de aterramento (Figura 2N) sobre a parte superior das costas da mosca usando os micromanipuladores.
   12. Insira o eletrodo de aterramento na parte de trás da braguilha usando os micromanipuladores.
   13. Insira o eletrodo de registro na periferia externa do olho da mosca, preferencialmente, usando micromanipuladores.
       nota: Depois de inserir o eletrodo no olho, uma pequena covinha será observada; Puxe o eletrodo para cima sem removê-lo do olho até que a covinha desapareça. Os eletrodos também podem ser imersos em pequenas gotículas de geléia de eletrodo aplicadas no tronco e no olho.
4. Protocolo PDA (este protocolo só pode ser realizado em moscas de olhos brancos)
   1. Dê um pulso de luz de 5 s de intensidade máxima usando um filtro laranja (filtro de borda 590, para converter o fotopigmento máximo para o estado R).
   2. Substitua o filtro laranja por um filtro azul de banda larga (BP450/40 nm) e dê três pulsos de luz de 5 s na intensidade máxima.
      NOTA: Também é possível fornecer um pulso de luz azul de intensidade máxima longa e contínua até que uma resposta de tensão de estado estacionário seja alcançada.
   3. Aguarde 60 s no escuro, substitua o filtro azul pelo filtro laranja anterior e dê dois pulsos de luz de 5 s com intervalos de 60 s.

Tabela 1: Composição da solução de Ringer

Solução de Ringer
Reagente	Concentração (mM)
NaCl	130
Kcl	algarismo
MgCl2	5
CaCl2	algarismo
HEPES	10
Titulação de pH para 7,15 usando NaOH e HCl

Resultados

Figura 1: Ferramentas e dispositivos necessários para a fixação da mosca e preparação da pipeta de registro. (A) Sistema de dormentes de mosca; (B) Pedal do sistema de dormentes de voo; (C) Fonte de luz fria; (D) Microscópio estereoscópico; (E) Aquecedor de filamentos de cera; (F) Ferro de soldar; (G) Pedal aquecedor de filamento de cera; (H) Pinças ásperas; (I) Suporte magnético para mosca; (J) Cera...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL com ponta alongada			Figura 1M
1 pinça áspera		Dumont #5, Padrão	0,1 mm x 0,06 mm, comprimento 110 mm, Inox (Figura 1H)
2 lentes condensadoras
Conversor A/D	Dispositivo molecular	Digidata 1200	Possível substituição: quaisquer digidata de dispositivos moleculares (por exemplo, 1440A) - Figura 2C
amplificador	Eletrônica quase perfeita		Possível substituição: Instrumentos Warner - IE251A ou IE-210 (vem com headstage) - Figura 2D
Mesa antivibração	Newport	VW-3036-OPT-01	Figura 7H
Capilares	Aparelho de Harvard	Capilares de vidro borossilicato	1 mm x 0,58 mm (Figura 1O)
Clampex	Dispositivo molecular		software
Tanque de CO2
Fonte de luz fria	Schott	KL1500 LCD	Figura 1C
Limpadores delicados	Kimtech		Kimwipes (Figura 1K)
Suporte de eletrodo			Adequado para diâmetro externo capilar de 1 mm (Figura 1N, Figura 2N e Figura 2P)
Gaiola de Faraday	Feito em casa		Blindagem contra ruído eletromagnético e cortina frontal preta (Figura 2K)
Filtro (cor)	Schott	OG590, filtro de borda	Figura 2S
Filtro (cor)	Schott	BP450/40 nm	Figura 2S
Filtro (cor)	Blazers	550 nm	Figura 2S
Filtro (cor) para fonte de luz fria	Schott	RG630	Figura 1C
Filtro (Calor)	Schott	KG3	Figura 1S
Filtros (filtro de densidade neutra)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0,5,0,3	Figura 2S
Sistema de lâmpada de flash	Honeywell		Figura 2U
Sistema de dormente com injetor	Injetar + matic		Figura 1A-B
Fonte de alimentação da lâmpada	Pti	LPS-220	Figura 2W
Detector de luz	Feito em casa		Fototransistor (Figura 2O)
Guia de luz			3 mm de diâmetro, 1,3 m de comprimento (Figura 2L,M)
luz			Lâmpada de xenônio de 75 W sem ozônio de alta pressão (operando em 50 W), possível substituição: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera de fusão de baixa temperatura	Feito em casa		Composto por uma mistura de cera de abelha (Tm≈62 °C) e parafina a ~3:1 para atingir uma temperatura de fusão de ~55–56 °C (Figura 6J)
Suporte magnético para moscas	Feito em casa		Figura 1I e Figura 2Q
Sistema de pré-amplificador de microeletrodo com estágio de cabeça	Eletrônica quase perfeita		Testador de impedância (Figura 2G)
Micromanipulador (mecânico grosso)	Pesquisa Tritech, Narishige	M-2
Micromanipulador (fino mecânico)	Leitz Microsystems	Micromanipulador Mecânico Leitz	Figura 2F
GRAMPO	Dispositivo molecular		software
Placa de Petri			60 milímetros
Gerador de pulsos	AMPI	Mestre 8	Figura 2A
Creme Redux para eletrocardiografia	Laboratórios Parker	Redux Creme Eletrolítico
Driver do obturador	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Canal Único Uni-estável	Figura 2V
Sistema de persiana	Uniblitz, Vincent Associates	Persianas LS2 2 mm Uni-estáveis	Figura 2V
Fio de prata	Warner Instruments		0,25–1 mm de diâmetro, precisa ser cloridizado
Ferro de solda composto por um filamento de platina-irídio			0,25 mm de diâmetro (Figura 2F)
Microscópio com zoom estereoscópico	Nikon	SMZ-2B	Figura 1D
Microscópio com zoom estereoscópico	selvagem	Selvagem M5	Com configurações de ampliação de 6, 12, 25 e 50 (Figura 2E)
Filtros de seringa	Millex		Filtro PVDF de 22 μm
Extrator de pipeta vertical	Sutter/ Narishige	Modelo P-97/PP-830	Use o extrator vertical ou horizontal, conforme preferir (Figura 1L)
Aquecedor de filamento de cera	Feito em casa		Figura 1E-G
Sistema de lâmpada de flash de xenônio	Dr. Rapp OptoEletrônico	JML-C2	Figura 2X