Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

Resumo

Fonte: Bosch, D., et al. Ex Vivo Dissecção Optogenética de Circuitos de Medo em Fatias de Cérebro. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que se ligam aos neurônios pós-sinápticos da amígdala, desencadeando correntes pós-sinápticas que são registradas para visualizar a conectividade mPFC-amígdala.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Visualização e Estimulação de Fibras Pré-Sinápticas

1. Prepare o microscópio de contato para ativação optogenética de fibras e células:
   1. Centralize o diodo emissor de luz (LED) montado no caminho de entrega de luz.
   2. Meça a intensidade da luz LED no plano focal traseiro e na saída de cada objetiva com um medidor de potência escolhendo o comprimento de onda apropriado de 470 nm.
   3. Calcule a intensidade da luz em mW/mm² e crie uma curva de calibração (intensidade do LED (%) versus saída de luz (mW/mm²)) para cada objetiva para valores medidos para comprimento de onda de 470 nm.
2. Recupere uma fatia aguda da amígdala da câmara de interface e coloque na câmara de fatia montada no microscópio vertical equipado com uma lâmpada fluorescente. Tome cuidado para posicionar a fatia de forma que a superfície da fatia voltada para cima na câmara de interface também esteja voltada para cima na câmara de gravação. Perfundir fatia com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado fresco (ACSF) a uma taxa de 1 - 2 ml/min a uma temperatura de ~31 °C.
3. Observe as fibras pré-sinápticas na fatia usando a lâmpada fluorescente em combinação com conjuntos de filtros apropriados para a proteína fluorescente específica expressa. Use a objetiva 5x para obter uma visão geral (Figura 1E) e a objetiva 60x para avaliação da densidade da fibra dentro da área-alvo.
   Nota: Para GFP e YFP, use o conjunto de filtros "verde" (Excitação 472/20, Divisor de feixe 495, Emissão 490 LP) para mCherry use o conjunto de filtros "vermelho" (Excitação 560/40, Divisor de feixe 585, Emissão 630/70) conforme especificado na tabela de materiais/equipamentos.
4. Abra ou restrinja a abertura no caminho da luz do microscópio conforme desejado para o experimento (Figura 2D).
5. Para obter um registro de patch, encha uma pipeta de patch com solução interna e monte-a no suporte do eletrodo. Aplique pressão positiva na pipeta de remendo e abaixe-a lentamente primeiro na solução do banho e, em seguida, sob controle visual na fatia usando o micromanipulador.
   1. Aproxime-se do neurônio de interesse com a pipeta de adesivo pela lateral e por cima. Libere pressão positiva quando a pipeta estiver na superfície da célula (covinha visível na superfície da célula) e obtenha um "gigaseal" aplicando pressão negativa.
   2. Aplique mais sucção para romper o adesivo de membrana para obter o registro de células inteiras. Posteriormente, estimule as fibras marcadas com o LED conectado usando o comprimento de onda apropriado para ativar a canalrodopsina (ChR) (470 nm) enquanto registra as respostas elétricas da célula.
   3. Para estimulação sináptica, comece com uma intensidade de LED baixa e aumente até atingir a amplitude de corrente sináptica desejada. Acione o LED configurando saídas digitais no software de aquisição de dados para controlar a temporização e o comprimento do pulso (exemplos na Figura 3).
      Nota: outros softwares e/ou dispositivos geradores de TTL podem ser usados para acionar o LED.
6. Repita a estimulação com abertura aberta ou restrita (etapa 1.4) na via de luz do microscópio conforme desejado para a próxima célula registrada e/ou na presença de medicamentos específicos.

Resultados

Figura 1. Injeções estereotáxicas, preparação de fatias cerebrais agudas e visualização de fibras pré-sinápticas. (A, B) Injeção de vírus estereotáxica. A) Imagem do camundongo anestesiado colocado em um quadro estereotáxico com o crânio exposto e a pipeta de injeção. Inserção: Amplie a imagem da pipeta de injeção cheia de solução de vírus misturada com verde rápido. Barra de escala:...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)	Para composição, consulte as referências # 16 e # 23
Soluções de patch interno	Para composição, consulte as referências # 16 e # 23
Sulfato de magnésio heptahidratado	Roth, Alemanha	Pág. 027.1	preparar solução estoque 2M em água purificada
Estereoscópio, SZX2-RFA16	Olympus, Japão
Lâmpada fluorescente Xcite (XI120Q-1492)	Grupo Lumen Dynamics, Canadá	2012-12699
Microscópio de contato, BX51WI	Olympus, Japão
Amplificador de patch Multiclamp 700B	Molecular Devices, EUA
Dados digitais 1440A	Molecular Devices, EUA
Software PClamp, versão 10	Molecular Devices, EUA		usado para controlar a aquisição e estimulação de dados
Controlador de temperatura do banho, TC05	Luigs & Neumann, Alemanha	200-100 500 0145
Micromanipulador de três eixos Mini 25	Luigs & Neumann, Alemanha	210-100 000 0010
Controlador para micromanipulador SM7	Luigs & Neumann, Alemanha	200-100 900 7311
Capilares de vidro para pipetas de remendo	World Precision Instruments, Alemanha	GB150F-8P
Papel de filtro de nitrato de celulose para câmara de interface	Satorius Stedim Biotech, Alemanha	13006--50----ACN
Unidade LED, CoolLED pE	CoolLED, Reino Unido	244-1400	CoolLED ou USL 70/470 e adaptadores apropriados são duas opções alternativas para estimulação de LED
CoolLED 100 Dual Adaptar	CoolLED, Reino Unido	pE-ADAPTOR-50E
Unidade de LED, USL 70/470	Rapp Optoeletrônico	L70-000
Adaptador de porta dupla	Rapp Optoeletrônico	Informe-se com a empresa
Conjunto de filtros vermelho (excitação)	AHF, Alemanha	F49-560	Os filtros podem ser comprados como conjunto F46-008
(divisor de feixe)	AHF, Alemanha	F48-585
(emissão)	AHF, Alemanha	F47-630
Conjunto de filtros verde (excitação)	AHF, Alemanha	F39-472	Alternativas: conjunto de filtros F36-149 ou F46-002 (com emissão passa-banda)
(divisor de feixe)	AHF, Alemanha	Rolamento F43-495W
(emissão)	AHF, Alemanha	F76-490
LaserCheck, medidor de energia portátil	Coerente, EUA	1098293
IgorPro Software, Versão 6	Wavemetrics, EUA		Para análise de dados de eletrofisiologia, outros pacotes de software alternativos também podem ser usados
Suíte neuromática de macros para IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com