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Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Fonte: Bosch, D., et al. Ex Vivo Dissecção Optogenética de Circuitos de Medo em Fatias de Cérebro. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que se ligam aos neurônios pós-sinápticos da amígdala, desencadeando correntes pós-sinápticas que são registradas para visualizar a conectividade mPFC-amígdala.

Protocol

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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Visualização e Estimulação de Fibras Pré-Sinápticas

  1. Prepare o microscópio de contato para ativação optogenética de fibras e células:
    1. Centralize o diodo emissor de luz (LED) montado no caminho de entrega de luz.
    2. Meça a intensidade da luz LED no plano focal traseiro e na saída de cada objetiva com um medidor de potência escolhendo o comprimento de onda apropriado de 470 nm.
    3. Calcule a intensidade da luz em mW/mm2 e crie uma curva de calibra....

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Results

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Figura 1. Injeções estereotáxicas, preparação de fatias cerebrais agudas e visualização de fibras pré-sinápticas. (A, B) Injeção de vírus estereotáxica. A) Imagem do camundongo anestesiado colocado em um quadro estereotáxico com o crânio exposto e a pipeta de injeção. Inserção: Amplie a imagem da pipeta de injeção cheia de solução de vírus misturada com verde rápido. Barra de escala:.......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)Para composição, consulte as referências # 16 e # 23
Soluções de patch internoPara composição, consulte as referências # 16 e # 23
Sulfato de magnésio heptahidratadoRoth, AlemanhaPág. 027.1preparar solução estoque 2M em água purificada
Estereoscópio, SZX2-RFA16Olympus, Japão
Lâmpada fluorescente Xcite (XI120Q-1492)Grupo Lumen Dynamics, Canadá2012-12699
Microscópio de contato, BX51WIOlympus, Japão
Amplificador de patch Multiclamp 700BMolecular Devices, EUA
Dados digitais 1440AMolecular Devices, EUA
Software PClamp, versão 10Molecular Devices, EUAusado para controlar a aquisição e estimulação de dados
Controlador de temperatura do banho, TC05Luigs & Neumann, Alemanha200-100 500 0145
Micromanipulador de três eixos Mini 25Luigs & Neumann, Alemanha210-100 000 0010
Controlador para micromanipulador SM7Luigs & Neumann, Alemanha200-100 900 7311
Capilares de vidro para pipetas de remendoWorld Precision Instruments, AlemanhaGB150F-8P
Papel de filtro de nitrato de celulose para câmara de interfaceSatorius Stedim Biotech, Alemanha13006--50----ACN
Unidade LED, CoolLED pECoolLED, Reino Unido244-1400CoolLED ou USL 70/470 e adaptadores apropriados são duas opções alternativas para estimulação de LED
CoolLED 100 Dual AdaptarCoolLED, Reino UnidopE-ADAPTOR-50E
Unidade de LED, USL 70/470Rapp OptoeletrônicoL70-000
Adaptador de porta duplaRapp OptoeletrônicoInforme-se com a empresa
Conjunto de filtros vermelho (excitação)AHF, AlemanhaF49-560Os filtros podem ser comprados como conjunto F46-008
(divisor de feixe)AHF, AlemanhaF48-585
(emissão)AHF, AlemanhaF47-630
Conjunto de filtros verde (excitação)AHF, AlemanhaF39-472Alternativas: conjunto de filtros F36-149 ou F46-002 (com emissão passa-banda)
(divisor de feixe)AHF, AlemanhaRolamento F43-495W
(emissão)AHF, AlemanhaF76-490
LaserCheck, medidor de energia portátilCoerente, EUA1098293
IgorPro Software, Versão 6Wavemetrics, EUAPara análise de dados de eletrofisiologia, outros pacotes de software alternativos também podem ser usados
Suíte neuromática de macros para IgorProhttp://www.neuromatic.thinkrandom.com

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Amygdala Brain SlicemPFC Amygdala ConnectivityChannelrhodopsin ActivationOptogenetic DissectionPatch Clamp RecordingFluorescence MicroscopyLED Light CalibrationPostsynaptic Current AnalysisFear Circuit MappingSynaptic Connectivity Visualization

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