Registro do Eletrorretinograma e do Potencial Evocado Visual em um Rato

Resumo

Fonte: Charng, J. et al. Implantação e Registro de Eletrorretinograma Sem Fio e Potencial Evocado Visual em Ratos Conscientes. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra como registrar o eletrorretinograma (ERG) e o potencial evocado visual (VEP) em um rato consciente. O rato, com eletrodos implantados cirurgicamente, é primeiro adaptado ao escuro. Após a aplicação de gotas dilatadoras, o animal é colocado em uma contenção e posicionado em uma tigela Ganzfeld. Os sinais ERG e VEP são então registrados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparando eletrodos

Nota: Um transmissor de três canais é usado para implantação cirúrgica, o que permite que 2 registros de eletrorretinograma (ERG) e 1 potencial evocado visual (VEP) sejam realizados simultaneamente. Os três eletrodos ativos e três inativos precisam ser pré-moldados em forma de anel antes da implantação para se fixarem ao olho. Para fins de identificação, o fabricante colocou eletrodos ativos em bainhas plásticas meio brancas e meio coloridas, enquanto os eletrodos inativos são cobertos por bainhas coloridas. O eletrodo de aterramento (bainha de plástico transparente) é deixado inalterado para que todos os eletrodos ativos e inativos conduzam as etapas 1.1, 1.2, 1.3 e 1.7.

1. Destorça o eletrodo de aço inoxidável de fita dupla com dois alicates de ponta fina.
2. Apare um dos fios de aço inoxidável (aproximadamente 1 cm da ponta), deixando um único fio reto mais longo restante para moldar o eletrodo do anel.
3. Dobre o único fio de aço inoxidável de volta sobre si mesmo e gire, formando um anel liso na ponta do eletrodo.
4. Para os eletrodos ativos do ERG, forme este laço ~ 0,2 - 0,5 mm de diâmetro torcendo a base do laço (para o propósito descrito aqui, molde dois eletrodos ativos desta forma para registrar o ERG de ambos os olhos) e, para os eletrodos ERG inativos e VEP, faça o diâmetro do laço ~ 0,8 mm de diâmetro (neste exemplo, faça isso para um eletrodo VEP ativo e todos os três eletrodos inativos).
5. Prenda o eletrodo ativo VEP circular em torno de um parafuso de aço inoxidável (diâmetro 0.7 mm, comprimento 3 mm) de forma que o eletrodo fique apoiado na cabeça do parafuso.
6. Prenda os 3 eletrodos inativos (2 ERG, 1 VEP) em torno de um segundo parafuso de aço inoxidável (diâmetro 0.7 mm, comprimento 3 mm).
7. Puxe a manga de plástico para frente sobre as pontas afiadas dos dois fios de aço inoxidável para reduzir a irritação.
8. Esterilize os transmissores de telemetria mergulhando-os em glutaraldeído a 2% por mais de 10 horas a aproximadamente 25 °C. Em seguida, enxágue o transmissor com solução salina estéril três vezes.

2. Implantação do transmissor

1. Preparação Animal
   1. Desinfete a área cirúrgica antes da experimentação, limpando-a com etanol 70%. Autoclave todo o equipamento cirúrgico antes de usar e mantenha o equipamento em clorexidina quando não estiver em uso durante a cirurgia. Cubra o animal com uma cortina cirúrgica durante a cirurgia para manter um ambiente estéril. Certifique-se de que todos os experimentadores usem máscaras cirúrgicas, luvas estéreis e aventais.
   2. Induzir anestesia com isoflurano a 1,5 a 2% a uma taxa de fluxo de 3 L/min e mantida a 1,5 a 2% a 2 L/min durante toda a cirurgia. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela ausência de um reflexo pedal ao beliscar o músculo entre os dedos dos pés.
   3. Raspe uma área de 40 mm x 30 mm sobre o abdômen, de cima da virilha até o esterno.
   4. Raspe uma área de 30 mm x 20 mm sobre a testa, posterior aos olhos e anterior às orelhas.
   5. Desinfete as duas áreas raspadas. Para a área da testa, desinfete com iodopovidona a 10% três vezes (evite o uso de anti-sépticos à base de álcool para a área próxima aos olhos, sendo consistente com o Padrão de Prática estabelecido pela Association of Surgical Technologists). Sobre o abdômen, desinfete com iodopovidona a 10% e etanol a 70%.
   6. Aplique 1 gota de proxymetacaína na córnea para anestesia tópica adicional.
   7. Aplique 1 gota de carboximetilcelulose sódica na córnea para evitar o ressecamento dos olhos.
2. Implante cirúrgico
   1. Faça uma incisão de 10 mm na cabeça ao longo da linha média vertical entre as orelhas com um bisturi cirúrgico.
   2. Faça uma incisão de 5 mm no abdômen através da camada de pele ao longo da linha média abaixo do esterno.
   3. Tunelamente uma cânula de 5 mm de diâmetro por via subcutânea da incisão do abdômen até a incisão da cabeça.
   4. Alimente os fios do eletrodo (3 ativos e 3 inativos) do transmissor através da cânula do abdômen até a cabeça.
   5. Deixe o eletrodo de referência com a base do transmissor e cubra a ponta do eletrodo com gaze asséptica.
   6. Cubra as pontas dos eletrodos (3 ativas e 3 inativas) com gaze asséptica.
   7. Prenda a cabeça do rato em uma plataforma estereotáxica.
   8. Estenda a incisão da testa para 30 mm de comprimento com tesoura cirúrgica.
   9. Exponha a área cirúrgica retraindo a pele solta com 2 suturas (3 - 0) em ~ 3 e 9 horas.
   10. Raspe o periósteo que cobre o crânio usando gaze esterilizada para expor as suturas de bregma, lambda e linha média.
   11. Faça dois furos no crânio nas coordenadas estereotáxicas VEP ativas (7 mm ventrais a bregma, 3 mm laterais a linha média) e inativas (5 mm rostral a bregma na linha média).
   12. Prenda os eletrodos ativos e inativos do VEP com parafusos de aço inoxidável pré-fixados (diâmetro 0.7 mm, comprimento 3 mm) ao crânio com uma pequena chave de fenda de ~ 1 mm de profundidade nos orifícios pré-fabricados. Isso ancora o parafuso ao osso sem danificar o tecido cortical subjacente.
   13. Para implantar os eletrodos ativos do ERG, use uma sutura 8 - 0 para retrair temporariamente a pálpebra superior.
   14. Insira uma cânula de 16 a 21 G por via subcutânea de trás do olho até o fórnice conjuntival superior.
   15. Remova a agulha guia.
   16. Passe o eletrodo ativo através do cateter de plástico encurtado da testa em direção ao olho. Em seguida, remova o cateter de plástico.
   17. Use uma sutura temporária (8 - 0), que é enfiada através do laço do eletrodo, para evitar que o eletrodo se retraia de volta para o túnel.
   18. Faça uma incisão de 0,5 mm na conjuntiva superior às 12 horas, 1 mm atrás do limbo. Use dissecção romba para expor a esclera subjacente.
   19. Implante uma sutura 8 - 0 ou 9 - 0 imediatamente atrás do limbo com meia espessura escleral.
   20. Remova a sutura temporária do eletrodo ativo do ERG.
   21. Ancore o eletrodo ativo ERG à sutura de meia espessura escleral amarrando 3 nós consecutivos, garantindo que a ponta do eletrodo esteja situada perto do limbo.
   22. Fechar o retalho conjuntival com 1 a 2 suturas interrompidas (8 - 0 a 9 - 0). Certifique-se de que a conjuntiva cubra completamente o eletrodo ERG para melhorar o conforto.
   23. Remova a sutura retrátil da pálpebra.
   24. Repita o procedimento para o olho contralateral.
   25. Aplique gel de cianoacrilato sobre o crânio para prender todos os parafusos de aço inoxidável e fios de eletrodo. Certifique-se de que os eletrodos ativos do ERG não estejam muito apertados antes de prendê-los para permitir os movimentos oculares.
   26. Feche o ferimento na cabeça usando uma sutura 3 - 0 não absorvível.
   27. Gire o roedor para expor a área abdominal. Alongue a incisão dérmica abdominal para 40 mm ao longo da linha alba com uma tesoura cirúrgica.
   28. Faça uma incisão de 35 mm através da parede muscular interna para expor a cavidade abdominal interna.
   29. Usando duas suturas (3 - 0), o corpo do transmissor é preso à parede abdominal interna do lado direito do animal. Evite entrar em contato com o fígado.
   30. Enrole o eletrodo de aterramento e prenda-o nesta forma com uma sutura (3 - 0). Em seguida, coloque-o flutuando livremente na cavidade abdominal.
   31. Feche o peritônio com uma sutura contínua (3 - 0).
   32. Feche a incisão na pele com suturas interrompidas (3 - 0).
3. Cuidados pós-operatórios
   1. Monitore o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Alojar o animal individualmente após a cirurgia.
   2. Administre carprofeno por via subcutânea para analgesia (5 mg / kg) uma vez ao dia durante 4 dias.
   3. Adicione antibióticos orais profiláticos (Enrofloxina, 5 mg / kg) à água potável por 7 dias após a cirurgia.
   4. Aplique uma pomada anti-inflamatória nos locais de incisão da pele para reduzir a irritação nos primeiros 7 dias após a cirurgia.

3. Realizar gravações de ERG e VEP em ratos conscientes

1. Animal de adaptação escura por 12 horas antes das gravações de ERG e VEP.
2. Realizar todas as manipulações experimentais sob iluminação vermelha fraca (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Aplique anestesia tópica (0,5% de proxymetacaína) e gotas dilatadoras (0,5% de tropicamida) na córnea.
4. Guie o roedor consciente para um limitador transparente feito sob medida.
   nota: O comprimento deste tubo de plástico pode ser ajustado para acomodar ratos de tamanhos diferentes, com o diâmetro total fixado em 60 mm. A extremidade frontal do dispositivo é cônica para minimizar o movimento da cabeça e contém perfurações para permitir a respiração normal. Esta frente cônica permite o alinhamento e estabilização da cabeça e dos olhos do rato para a abertura da esfera de Ganzfeld. Observe que o roedor foi aclimatado ao limitador (3 a 5 ocasiões) antes da cirurgia.
5. Coloque o roedor na frente da tigela de Ganzfeld com os olhos alinhados com a abertura da tigela.
6. Ligue o transmissor interno passando um ímã a ~ 5 cm dele. Em seguida, verifique se o transmissor está ligado verificando a luz de status do LED na base do receptor.
7. Colete sinais em uma faixa de energias luminosas (ou seja, -5,6 a 1,52 log cd.s.m²).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioamplificador	ADInstruments	ML 135	Amplifica sinais ERG e VEP
Carboximetilcelulose sódica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Mantenha a hidratação da córnea durante a cirurgia
Carprofeno 0,5%	Grupo de Saúde Animal Pfizer	CAS 53716-49-7	Analgesia pós-cirúrgica, administrada com solução salina injetável para reposição de líquidos
Clorhexadina 0,5%	Laboratórios Orion	27411, 80085	Desinfecção de instrumentos cirúrgicos
Ativador de gel de cianoacrilato	Componentes RS	473-439	Seca rapidamente o gel de cianoacrilato
Gel de cianocrilato	Componentes RS	Rolamento 473-423	Fixe os parafusos de aço inoxidável no crânio
Broca dentária	Instrumentos Storz, Bausch e Lomb	E0824A	Cabeça de broca em miniatura de ~ 0,7 mm de diâmetro para fazer um pequeno orifício no crânio sobre cada hemisfério para implantar parafusos VEP
broca	Bosch	Série Dremel 300	Furadeira automática para trepanação
Enrofloxina	Laboratórios Troy		Antibiótico profilático pós-cirurgia
Esfera integradora de Ganzfeld	Soluções Fotométricas Internacional		Estimulador de luz personalizado: 36 mm de diâmetro, tamanho de abertura de 13 cm
Cotonetes de gaze	Produtos Médicos Multigate Pty Ltd	57-100B	Seca a incisão cirúrgica e a superfície do crânio exposta durante a cirurgia
Isoflurano 99,9%	Abbott Australásia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nome Proprietário: Anestésico por inalação Isoflo(TM). Anestésico inalatório de grau farmacêutico misturado com gás oxigênio para cirurgia de implante de eletrodo VEP
Pomada Kenacomb	Aspen Pharma Pty Ltd		Para reduzir a irritação e coceira da pele após a cirurgia
LEDs Luxeon	Phillips Iluminação Co.		Para estimulação de luz, vinte LEDs de 5 watts e um de 1 watt, controlados pelo software Scope
Agulha (macrocirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	501959	para sutura de cirurgia abdominal e de cabeça, usado com sutura 3-0, agulha de olho, ponta 5/16 de círculo Tamanho 1, 15mm
Porta-agulha (macrocirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	500224	Para segurar a agulha durante a cirurgia abdominal e da cabeça
Porta-agulha (microcirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 555419NT	Para segurar a agulha durante a cirurgia ocular
Cateter Optiva	Smiths Medical International LTDA	16 ou 21 g	Guie os eletrodos ativos da córnea do crânio à conjuntiva
Iodopovidona 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nome proprietário: Betadine, Anti-séptico para preparar a pele raspada para cirurgia 10%, 500 mL
Sistema de aquisição de dados Powerlab	ADInstruments	ML 785	Adquira o sinal do transmissor de telemetria, emparelhado com o conversor de dados de telemetria
Proxymetacaína 0,5%	Laboratórios Alcon	CAS 5875-06-9	Analgesia ocular tópica
Restrição	cutom feito		A frente do limitador é afilada para minimizar o movimento da cabeça, o comprimento pode ser ajustado para acomodar diferentes comprimentos de ratos, o diâmetro total é de 60 mm.
Lâmina Scapel	R.G. Suprimentos Médicos	SNSM0206	Para incisão cirúrgica
Tesoura (macrocirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	501225	para cortar tecidos no abdmen e na testa
Tesoura (microcirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	501232	Para dissecar a conjuntiva para fixação do eletrodo
Software de escopo	ADInstruments	Versão 3.7.6	Aciona simultaneamente o estímulo por meio do sistema ADI Powerlab e coleta dados
barbeador	Oster	Dourado A5	Depile o pelo das áreas cirúrgicas
Parafusos de aço inoxidável	MicroFixadores	L001.003CS304	Diâmetro do eixo de 0,7 mm, 3 mm de comprimento
Quadro estereotáxico	David Kopf	Modelo 900	Um pequeno instrumento estereotáxico animal para localizar os pontos de referência de implantação no crânio
Campo cirúrgico	Suprimentos médicos vitais	GM29-612EE	Garanta um ambiente estéril durante a cirurgia
Sutura (macrocirurgia)	Agulhas médicas Ninbo	3-0	para sutura de cirurgia abdominal e de cabeça, trançado de seda estéril, 60cm
Agulha de sutura (microcirurgia)	Agulhas médicas Ninbo	8-0 ou 9-0	para cirurgia ocular, incluindo, eletrodo de sutura à esclera e fechamento da ferida conjuntival, sutura de nylon, círculo 3/8 1×5, 30cm
Conversor de dados de telemetria	Ciências de Dados Internacional	R08	permite que o sinal de telemetria faça interface com o software de coleta de dados
Matriz de troca de dados de telemetria	Ciências de Dados Internacional		Reúne dados de transmissores, emparelha com o receptor
Receptor de dados de telemetria	Ciências de Dados Internacional	RPC-1	Recebe dados de telemetria do transmissor
Transmissor de telemetria	Ciências de Dados Internacional	F50-EEE	Transmissor de telemetria de 3 canais
Tropicamida 0,5%	Laboratórios Alcon		Dilatação da íris
Pinças (macrocirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	500092	Manipular tecidos durante cirurgias abdominais e de cabeça
Pinças (microcirurgia)	Instrumentos de precisão mundiais	500342	Manipular tecidos durante a cirurgia ocular