Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Montagem do dispositivo de sonda-eletrodo de microdiálise
- Use um eletrodo de duas torções de 3 canais (com pelo menos um comprimento de corte de 20 mm do eletrodo de registro e um eletrodo de aterramento de 10 cm de comprimento) e acople-o a uma cânula guia para preparar o dispositivo. Veja exemplos de eletrodos de 3 canais e cânula guia para diálise na Figura 1A-1B.
- Remova (Figura 1C) e insira (Figura 1D) a cânula guia de metal na cânula plástica fictícia algumas vezes antes do uso, a fim de facilitar sua remoção no momento de sua troca para sonda de microdiálise em animal.
- Dobre os fios torcidos do eletrodo de registro duas vezes (Figura 1E-1F) para alinhar os fios com a cânula fictícia da guia e corte a ponta do eletrodo (Figura 1G) 0,5 mm mais longa que a ponta da cânula guia (Figura 1H) usando o paquímetro digital.
- Prepare a argola de silicone de 1 mm de comprimento (diâmetro externo [OD] 2 mm, espessura 0,3 mm; Figura 1I) e insira a ponta da cânula guia e a ponta dos eletrodos torcidos no diadema de silicone usando a pinça (Figura 1J). Fixe-o no pé do pedestal da cânula guia com cola de polímero de ação rápida ou resina (Figura 1K). Veja o example dos dispositivos concluídos na Figura 1L e Figura 2A.
- Esterilize o dispositivo sob luz ultravioleta (UV) germicida por 4 h. Vire o dispositivo quatro vezes para que cada um de seus lados fique exposto à luz por 1 h.
nota: Muitos eletrodos caseiros e sondas de microdiálise podem ser montados de maneira semelhante. A cabeça do implante acima descrito para ratos tem as seguintes dimensões: 7 mm de largura x 5 mm de profundidade x 10 mm de comprimento da parte superior ao pedestal do dedo do pé; A ponta do implante tem cerca de 11 mm de comprimento, 600 μm de diâmetro e todo o dispositivo pesa cerca de 330-360 mg. O dispositivo pode ser reutilizado duas ou três vezes se i) for deixado no crânio um comprimento suficiente do eléctrodo de massa durante a cirurgia para a utilização seguinte e ii) quando o animal for abatido e o dispositivo recuperado juntamente com o cimento dentário for deixado em acetona durante a noite, de modo a que o cimento possa ser desagregado mecanicamente, e o dispositivo lavado e esterilizado novamente.
2. Cirurgia Estereotáxica
- Utilizar aparelho estereotáxico e suporte de clipe de sonda (Figura 2B) para o implante do dispositivo seguindo os padrões contemporâneos para cirurgias assépticas e indolores.
- Anestesiar os ratos adultos de Sprague-Dawley com a mistura de cetamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, por via intraperitoneal [i.p.]) e fixá-la na estrutura estereotáxica. Adicione anestesia com isoflurano (1,4% no ar; 1,2 mL/min) à injeção inicial de cetamina/xilazina, pois permite controlar a profundidade da anestesia no tempo. Raspe o pelo da cabeça do animal.
- Limpe a superfície da pele da cabeça com solução à base de iodo seguida de etanol a 70% para prepará-la para cirurgia asséptica.
- Implante o dispositivo de cânula-eletrodo guia preparado em precedência (1.1 – 1.5) no hipocampo ventral direito usando as seguintes coordenadas: barra nasal + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm para bregma. Siga as técnicas padrão para cirurgias estereotáxicas.
- Certifique-se de que não cobre os parafusos de ancoragem. Ao montá-lo no aparelho estereotáxico, segure o dispositivo pela cabeça da cânula guia, pois ela pode ser facilmente alinhada ao suporte da sonda.
- Ancore o dispositivo ao crânio com pelo menos quatro parafusos de aço inoxidável aparafusando-os no osso do crânio (1 parafuso nas placas ósseas frontais esquerda e 1 parafuso nas placas ósseas frontais direitas, 1 parafuso nas placas ósseas parietais esquerdas e 1 parafuso nas placas ósseas interparietais). Adicione uma gota de cola de tecido para fixar ainda mais cada parafuso ao osso do crânio.
- Cubra metade das roscas dos parafusos com cimento metacrílico. Promova a ligação do cimento fazendo sulcos rasos no osso para aumentar a aderência.
- Assim que a ponta do dispositivo estiver posicionada no tecido cerebral, torça o fio do eletrodo de aterramento em torno de 3 parafusos de ancoragem. Cubra todos os parafusos montados e o dispositivo com cimento dentário.
- Monitore os animais durante a cirurgia e por cerca de 1 h depois até que estejam em pé e se movendo ao redor da gaiola. Mantenha-os em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Permita que os ratos se recuperem por pelo menos 7 dias após a implantação do dispositivo.
- Monitore os animais pelo menos uma vez ao dia durante 3 dias após a cirurgia para detectar sinais de dor ou angústia. Dê aos animais o creme antibiótico (gentamicina 0,1%) próximo ao local da incisão para prevenir a infecção e um analgésico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) por 3 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.
3. Indução de Epilepsia do Lobo Temporal por Pilocarpina e Atribuição de Animais a Grupos Experimentais
- Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, atribuir os animais aleatoriamente aos grupos: (i) animais controle recebendo veículo e (ii) animais epilépticos que receberão pilocarpina. Use um número proporcionalmente maior de animais para o grupo epiléptico, pois nem todos os ratos administrados com pilocarpina desenvolverão a doença.
- Injete uma dose de metilescopolamina (1 mg/kg, por via subcutânea [s.c.]) e 30 min após, uma única injeção de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para induzir o estado de mal epiléptico (SE). Injete metilescopolamina e o veículo (solução salina) nos ratos de controle. Use uma seringa de 1 mL com agulha 25G para todas as administrações intravenosas.
- Verifique visualmente os animais para começar a ter convulsões comportamentais (movendo a vibrissa dentro de 5 min, balançando a cabeça, clonando os membros) e dentro de 25 min para clonar continuamente todo o corpo (SE).
- Pare o SE 2 h após o início para ter uma mortalidade de cerca de 25% e um período latente médio de aproximadamente 10 dias pela administração de diazepam (20 mg / kg, i.p.). Observe e registre qualquer comportamento convulsivo começando imediatamente após a injeção de pilocarpina e continue por pelo menos 6 h depois.
- Dê aos animais solução salina (1 mL, i.p.) usando 1 mL de seringa com agulha 25G e solução de sacarose (1 mL, v.o.) usando 1 mL de seringa e alimentação flexível com agulha 17G por 2-3 dias após o SE para promover a recuperação da perda de peso corporal.
- Excluir do estudo os animais que não atingirem o peso corporal inicial na primeira semana após a pilocarpina SE (exceto para o grupo agudo morto 24 h após SE, onde o acompanhamento do peso corporal não é possível).
- Atribua os animais pós-SE aleatoriamente a diferentes grupos experimentais (Figura 3): fase aguda (onde a microdiálise ocorre 24 h após SE), latência (7-9 dias após SE), primeira convulsão espontânea (aproximadamente 11 dias após SE) e período crônico (começa cerca de 22-24 dias após SE, ou seja, cerca de 10 dias após a primeira convulsão). Monitore os animais quanto à ocorrência de crises espontâneas.
nota: Use os seguintes critérios de inclusão/exclusão para experimentos adicionais em ratos epilépticos: desenvolvimento de SE convulsivo dentro de 1 h após a administração de pilocarpina; ganho de peso na primeira semana após o SE e o posicionamento correto da sonda de microdiálise e do eletrodo.
4. Monitoramento e Análise do Comportamento Epiléptico
- Monitoramento de longo prazo do comportamento epiléptico
- Aproximadamente 6 h após a administração da pilocarpina (ou seja, ao final da observação direta pelos pesquisadores), coloque os animais nas gaiolas domésticas limpas e inicie o videomonitoramento 24 h.
- Continue a videomonitorização 24 h até ao dia 5, utilizando um sistema de videovigilância digital.
- A partir do dia 5, conecte os ratos em suas gaiolas retangulares domésticas ao sistema de gravação de EEG amarrado e continue o monitoramento de vídeo 24 horas.
- Defina os parâmetros no amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday (defina o fator de amplificação em cada canal de acordo com a especificidade do sinal de EEG de cada animal) e inicie a aquisição de EEG observando o sinal de EEG produzido por cabos desconectados. Use um samptaxa de amostragem de 200 Hz e filtro passa-baixo definido para 0,5 Hz.
- Conecte o animal a cabos que seguram a cabeça de um animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Inicie a aquisição.
cuidado: Certifique-se de que o sinal esteja livre de artefatos. Artefatos comuns são picos que excedem em muito a escala.
- Um dia antes do experimento de microdiálise, transfira os animais para o sistema de EEG amarrado equipado com cilindros de plexiglass para microdiálise. Desconecte os animais do sistema de amarração EEG na gaiola doméstica, aparafusando os conectores do eletrodo sem conter o animal. Coloque o animal nos cilindros altos de plexiglass.
