Registro eletroencefalográfico de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Montagem do dispositivo de sonda-eletrodo de microdiálise

1. Use um eletrodo de duas torções de 3 canais (com pelo menos um comprimento de corte de 20 mm do eletrodo de registro e um eletrodo de aterramento de 10 cm de comprimento) e acople-o a uma cânula guia para preparar o dispositivo. Veja exemplos de eletrodos de 3 canais e cânula guia para diálise na Figura 1A-1B.
2. Remova (Figura 1C) e insira (Figura 1D) a cânula guia de metal na cânula plástica fictícia algumas vezes antes do uso, a fim de facilitar sua remoção no momento de sua troca para sonda de microdiálise em animal.
3. Dobre os fios torcidos do eletrodo de registro duas vezes (Figura 1E-1F) para alinhar os fios com a cânula fictícia da guia e corte a ponta do eletrodo (Figura 1G) 0,5 mm mais longa que a ponta da cânula guia (Figura 1H) usando o paquímetro digital.
4. Prepare a argola de silicone de 1 mm de comprimento (diâmetro externo [OD] 2 mm, espessura 0,3 mm; Figura 1I) e insira a ponta da cânula guia e a ponta dos eletrodos torcidos no diadema de silicone usando a pinça (Figura 1J). Fixe-o no pé do pedestal da cânula guia com cola de polímero de ação rápida ou resina (Figura 1K). Veja o example dos dispositivos concluídos na Figura 1L e Figura 2A.
5. Esterilize o dispositivo sob luz ultravioleta (UV) germicida por 4 h. Vire o dispositivo quatro vezes para que cada um de seus lados fique exposto à luz por 1 h.
   nota: Muitos eletrodos caseiros e sondas de microdiálise podem ser montados de maneira semelhante. A cabeça do implante acima descrito para ratos tem as seguintes dimensões: 7 mm de largura x 5 mm de profundidade x 10 mm de comprimento da parte superior ao pedestal do dedo do pé; A ponta do implante tem cerca de 11 mm de comprimento, 600 μm de diâmetro e todo o dispositivo pesa cerca de 330-360 mg. O dispositivo pode ser reutilizado duas ou três vezes se i) for deixado no crânio um comprimento suficiente do eléctrodo de massa durante a cirurgia para a utilização seguinte e ii) quando o animal for abatido e o dispositivo recuperado juntamente com o cimento dentário for deixado em acetona durante a noite, de modo a que o cimento possa ser desagregado mecanicamente, e o dispositivo lavado e esterilizado novamente.

2. Cirurgia Estereotáxica

1. Utilizar aparelho estereotáxico e suporte de clipe de sonda (Figura 2B) para o implante do dispositivo seguindo os padrões contemporâneos para cirurgias assépticas e indolores.
   1. Anestesiar os ratos adultos de Sprague-Dawley com a mistura de cetamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, por via intraperitoneal [i.p.]) e fixá-la na estrutura estereotáxica. Adicione anestesia com isoflurano (1,4% no ar; 1,2 mL/min) à injeção inicial de cetamina/xilazina, pois permite controlar a profundidade da anestesia no tempo. Raspe o pelo da cabeça do animal.
2. Limpe a superfície da pele da cabeça com solução à base de iodo seguida de etanol a 70% para prepará-la para cirurgia asséptica.
   1. Implante o dispositivo de cânula-eletrodo guia preparado em precedência (1.1 – 1.5) no hipocampo ventral direito usando as seguintes coordenadas: barra nasal + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm para bregma. Siga as técnicas padrão para cirurgias estereotáxicas.
   2. Certifique-se de que não cobre os parafusos de ancoragem. Ao montá-lo no aparelho estereotáxico, segure o dispositivo pela cabeça da cânula guia, pois ela pode ser facilmente alinhada ao suporte da sonda.
3. Ancore o dispositivo ao crânio com pelo menos quatro parafusos de aço inoxidável aparafusando-os no osso do crânio (1 parafuso nas placas ósseas frontais esquerda e 1 parafuso nas placas ósseas frontais direitas, 1 parafuso nas placas ósseas parietais esquerdas e 1 parafuso nas placas ósseas interparietais). Adicione uma gota de cola de tecido para fixar ainda mais cada parafuso ao osso do crânio.
   1. Cubra metade das roscas dos parafusos com cimento metacrílico. Promova a ligação do cimento fazendo sulcos rasos no osso para aumentar a aderência.
4. Assim que a ponta do dispositivo estiver posicionada no tecido cerebral, torça o fio do eletrodo de aterramento em torno de 3 parafusos de ancoragem. Cubra todos os parafusos montados e o dispositivo com cimento dentário.
5. Monitore os animais durante a cirurgia e por cerca de 1 h depois até que estejam em pé e se movendo ao redor da gaiola. Mantenha-os em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Permita que os ratos se recuperem por pelo menos 7 dias após a implantação do dispositivo.
6. Monitore os animais pelo menos uma vez ao dia durante 3 dias após a cirurgia para detectar sinais de dor ou angústia. Dê aos animais o creme antibiótico (gentamicina 0,1%) próximo ao local da incisão para prevenir a infecção e um analgésico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) por 3 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.

3. Indução de Epilepsia do Lobo Temporal por Pilocarpina e Atribuição de Animais a Grupos Experimentais

1. Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, atribuir os animais aleatoriamente aos grupos: (i) animais controle recebendo veículo e (ii) animais epilépticos que receberão pilocarpina. Use um número proporcionalmente maior de animais para o grupo epiléptico, pois nem todos os ratos administrados com pilocarpina desenvolverão a doença.
2. Injete uma dose de metilescopolamina (1 mg/kg, por via subcutânea [s.c.]) e 30 min após, uma única injeção de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para induzir o estado de mal epiléptico (SE). Injete metilescopolamina e o veículo (solução salina) nos ratos de controle. Use uma seringa de 1 mL com agulha 25G para todas as administrações intravenosas.
   1. Verifique visualmente os animais para começar a ter convulsões comportamentais (movendo a vibrissa dentro de 5 min, balançando a cabeça, clonando os membros) e dentro de 25 min para clonar continuamente todo o corpo (SE).
3. Pare o SE 2 h após o início para ter uma mortalidade de cerca de 25% e um período latente médio de aproximadamente 10 dias pela administração de diazepam (20 mg / kg, i.p.). Observe e registre qualquer comportamento convulsivo começando imediatamente após a injeção de pilocarpina e continue por pelo menos 6 h depois.
4. Dê aos animais solução salina (1 mL, i.p.) usando 1 mL de seringa com agulha 25G e solução de sacarose (1 mL, v.o.) usando 1 mL de seringa e alimentação flexível com agulha 17G por 2-3 dias após o SE para promover a recuperação da perda de peso corporal.
   1. Excluir do estudo os animais que não atingirem o peso corporal inicial na primeira semana após a pilocarpina SE (exceto para o grupo agudo morto 24 h após SE, onde o acompanhamento do peso corporal não é possível).
5. Atribua os animais pós-SE aleatoriamente a diferentes grupos experimentais (Figura 3): fase aguda (onde a microdiálise ocorre 24 h após SE), latência (7-9 dias após SE), primeira convulsão espontânea (aproximadamente 11 dias após SE) e período crônico (começa cerca de 22-24 dias após SE, ou seja, cerca de 10 dias após a primeira convulsão). Monitore os animais quanto à ocorrência de crises espontâneas.
   nota: Use os seguintes critérios de inclusão/exclusão para experimentos adicionais em ratos epilépticos: desenvolvimento de SE convulsivo dentro de 1 h após a administração de pilocarpina; ganho de peso na primeira semana após o SE e o posicionamento correto da sonda de microdiálise e do eletrodo.

4. Monitoramento e Análise do Comportamento Epiléptico

1. Monitoramento de longo prazo do comportamento epiléptico
   1. Aproximadamente 6 h após a administração da pilocarpina (ou seja, ao final da observação direta pelos pesquisadores), coloque os animais nas gaiolas domésticas limpas e inicie o videomonitoramento 24 h.
   2. Continue a videomonitorização 24 h até ao dia 5, utilizando um sistema de videovigilância digital.
   3. A partir do dia 5, conecte os ratos em suas gaiolas retangulares domésticas ao sistema de gravação de EEG amarrado e continue o monitoramento de vídeo 24 horas.
   4. Defina os parâmetros no amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday (defina o fator de amplificação em cada canal de acordo com a especificidade do sinal de EEG de cada animal) e inicie a aquisição de EEG observando o sinal de EEG produzido por cabos desconectados. Use um samptaxa de amostragem de 200 Hz e filtro passa-baixo definido para 0,5 Hz.
   5. Conecte o animal a cabos que seguram a cabeça de um animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Inicie a aquisição.
      cuidado: Certifique-se de que o sinal esteja livre de artefatos. Artefatos comuns são picos que excedem em muito a escala.
   6. Um dia antes do experimento de microdiálise, transfira os animais para o sistema de EEG amarrado equipado com cilindros de plexiglass para microdiálise. Desconecte os animais do sistema de amarração EEG na gaiola doméstica, aparafusando os conectores do eletrodo sem conter o animal. Coloque o animal nos cilindros altos de plexiglass.

Figura 1. Preparação passo a passo do dispositivo a ser implantado. (A) Eletrodo de 3 canais com eletrodo de aterramento de 10 cm de comprimento em sua manga protetora à esquerda e cânula guia para microdiálise à direita necessária para montar o dispositivo. (B). O eletrodo nu e a cânula guia em detalhes. O primeiro passo é remover (C) e inserir (D) a cânula guia de metal de e em seu manequim de plástico algumas vezes para facilitar sua liberação uma vez implantada na cabeça do animal. O segundo passo é dobrar duas vezes o eletrodo de registro torcido a ser alinhado à cânula guia de diálise (E, F). (G) A ponta do eletrodo deve ser cortada para ser 0.5 mm mais longa que a ponta da cânula guia de metal. (H) Verifique a precisão do corte usando o paquímetro digital. Posteriormente, deve-se usar diadema de silicone com cerca de 1 mm de comprimento para fixar o alinhamento do eletrodo ao pé da cânula guia (I). (J) A fotografia mostrando como tocar o eletrodo e o eixo da cânula guia. A etapa final é colocar uma gota de resina ou cola no pedestal da cânula guia fixando a argola de silicone a ela (K). (L) Dispositivo montado pronto para ser esterilizado.

Figura 2. Fotografias de diferentes tipos de dispositivos para microdiálise-EEG em ratos utilizados (A) e a fotografia do suporte do clipe da sonda (B) utilizado para implantar esses dispositivos. (A) A cânula guia (em verde) é substituída por uma cânula de microdiálise normalmente 24 horas antes do experimento. O conector elétrico do dispositivo (o primeiro à esquerda foi usado para as gravações descritas neste manuscrito) permite a conexão de fios que conduzem o sinal elétrico ao amplificador e ao equipamento de coleta de dados. O dispositivo é fixado cirurgicamente ao crânio de ratos anestesiados e as gravações podem ser obtidas posteriormente sem causar dor ou desconforto em ratos que se comportam livremente.

Figura 3. Desenho experimental. Na semana anterior à indução do estado de mal epiléptico (SE), os ratos são implantados com o dispositivo. O SE é induzido por pilocarpina e os animais (se não forem dialisados e mortos 24 h após o SE; os ratos do grupo agudo) são monitorados por vídeo por 5 dias (linha azul) e, em seguida, monitorados por vídeo-EEG para avaliar a frequência e a duração das convulsões em suas gaiolas domésticas (linha verde). Para o experimento de microdiálise, os ratos epilépticos e respectivos controles não epilépticos são transferidos para outro EEG montado equipado com gaiolas cilíndricas em 24 h antes da sessão de microdiálise e ainda monitorado por vídeo-EEG (linha verde clara). As linhas vermelhas verticais representam as sessões de diálise em diferentes momentos do desenvolvimento da doença epiléptica. As linhas vermelhas horizontais representam os diferentes grupos de animais epilépticos (e respectivos animais não epilépticos), onde a seta indica o último dia da microdiálise e o dia da morte do animal.