Registro de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo neuronal em fatias agudas do hipocampo

Resumo

Fonte: Weng, W., et al. Registrando a plasticidade sináptica em fatias agudas do hipocampo mantidas em um sistema de câmara do tipo reciclagem, perfusão e submersão de pequeno volume. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento para configurar uma fatia de cérebro em uma câmara de submersão para registrar a atividade sináptica. O processo envolve prender a fatia no papel da lente, manter um fluxo contínuo de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) para garantir a viabilidade neuronal e posicionar com precisão os eletrodos de estimulação e registro em relação a uma região específica do cérebro de interesse. Essa configuração permite o monitoramento preciso da atividade sináptica basal e dos efeitos da estimulação elétrica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Registrando respostas sinápticas em uma câmara de fatia de submersão

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais.

1. Pré-aqueça a solução de aCSF em banho-maria a cerca de 28-30 °C (isso evitará a formação de bolhas na câmara de registro).
2. Ligue o sistema de reciclagem (4-5 mL/min) e ative o aquecedor em linha para equilibrar o sistema por pelo menos 1 h.
3. Mergulhe um pequeno pedaço de papel de limpeza de lentes e uma malha de náilon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de submersão por alguns minutos (Figura 1).
4. Remova o fio de platina em forma de U.
5. Desligue a reciclagem e coloque uma fatia no papel de limpeza da lente.
6. Coloque imediatamente a malha de retenção da fatia em cima da fatia, ligue a bomba e deixe a fatia equilibrar por 30 min sem mergulhar a objetiva no aCSF.
7. Encha a micropipeta de borossilicato (ou seja, o eletrodo de registro) com aCSF (resistência da ponta: 1-2 MΩ, preenchida 1/3 com aCSF) e monte-a no porta-pipetas.
8. Coloque o eletrodo de estimulação de tungstênio isolado com epóxi testado no suporte do manipulador e os fios de referência na câmara de fatia.
9. Adicione um segundo eletrodo de referência à câmara e conecte-o ao soquete de referência do headstage do eletrodo de registro (Figura 1A).
10. No ampsoftware de controle do amplificador, clique na caixa "zero clamp mode" e prossiga clicando duas vezes na caixa "lista de ganho de saída". Escolha um ganho de "100", clique duas vezes na "caixa de listagem do filtro passa-alta (Bessel)", escolha "0.1 Hz" e clique duas vezes na "caixa de listagem do filtro passa-baixo (AC)" para escolher "3 kHz".
11. No software de gravação, clique em "Adquirir | Escolha um protocolo que tenha configurações que permitam estímulos episódicos e a digitalização de potenciais amplificados em 10-20 kHz por 50-100 ms e que acione automaticamente um isolador de estímulo 10 ms após o início de uma gravação episódica.
12. Coloque os eletrodos de estimulação e registro alinhados e paralelos ao estrato piramidal, por exemplo (Figura 1B e Figura 2).
13. Clique em "Adquirir | Editar protocolo" e escolha a guia "gatilho" (na janela pop-up). Clique na caixa "fonte do gatilho" e escolha "barra de espaço" como fonte do gatilho. Clique no botão "OK". Clique no botão "gravar" para iniciar a aquisição e observe a janela pop-up com um botão de gatilho.
14. No software isolador de estímulo, clique na caixa "voltage controle" e digite "0". Clique no botão "download". Clique na janela "software de gravação" e pressione a barra de espaço. Repita este ciclo inserindo sequencialmente valores de 1 a 8, por exemplo, em passos de 1 mV na caixa "voltage controle".
15. Correlacione a força de estimulação com os valores de inclinação de fEPSP e determine a força de estimulação necessária para obter 40% do máximo de inclinação de fEPSP. Clique na "caixa de controle de tensão" e insira o valor determinado. Clique no botão "download".
    nota: Um isolador de estímulo é usado para aplicar breves pulsos de tensão ou corrente ao tecido cerebral. Os pulsos bifásicos podem ter 100 μs por fase.
16. No software de gravação, clique no botão Parar e depois no menu "Adquirir". Clique em "Editar protocolo" e escolha a guia "gatilho" na janela pop-up. Clique na caixa de fonte do gatilho e escolha o "temporizador interno" como a fonte do gatilho. Clique no botão "OK". Clique no botão de gravação que inicia o registro automático de potenciais de campo a cada 30 s, por exemplo. Clique no botão "parar" após 30-60 min.
17. Clique no menu "Adquirir", clique em "Abrir Protocolo", escolha o protocolo de indução desejado de plasticidade sináptica e clique no botão "OK". Clique no botão "gravar" para ativar automaticamente a estimulação e gravação de alta frequência. Clique no botão "parar".
    nota: No caso de estudos relacionados à plasticidade sináptica, aplique um dos paradigmas de indução padrão para potenciação de longo prazo ou depressão de longo prazo após registro basal prolongado. Exemplos representativos da modulação resultante da transmissão sináptica são representados na Figura 4 e na Figura 5.
18. No software de gravação, clique em "Adquirir | Open Protocol" e escolha o mesmo protocolo da etapa 4.12. Clique no botão "OK" e depois clique em "gravar". Continue executando automaticamente as gravações potenciais de campo por 2-4 h, por exemplo. Clique no botão "parar" para encerrar a gravação.
19. No caso de estudos farmacêuticos, aplique o composto diretamente no reservatório de aCSF se for desejada a administração permanente do composto (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Componentes de escoamento-carbogenação para experimentos em uma câmara de fatia de submersão. (A) Apresentação da câmara de corte de submersão. O fio de platina em forma de U com fibras de náilon segurando uma fatia do hipocampo é representado. Os fios de prata foram enrolados em uma pequena cânula, criando uma bobina para aumentar a área da extremidade do fio de prata. O f...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamentos e materiais de eletrofisiologia
Extrator de pipeta vertical	Narishige, Japão	PC-10
Tabela de isolamento de vibração	Meirits, Japão	ADZ-A0806
Câmara de gravação do tipo submersa	Warner Instruments	RC-26GLP
Banho-maria termostático	Zhongcheng Yiqi, China	HH-1
Micromanipulador de 4 eixos	Sutter, Estados Unidos	MP-285, MP-225
Fio de platina	Instrumentos de precisão mundiais	PTP406
amplificador	Molecular Devices, EUA	Grampo múltiplo 700B
Sistema de aquisição de dados	Molecular Devices, EUA	Digidata 1440A
Software de análise	Molecular Devices, EUA	Clampex 10.2
Microscópio de fluorescência	Nikon, Japão	FN1
Fonte de luz LED	Grupo Lumen Dynamics, Canadá	X-cite 120LED
Micropipetas	Aparelho de Harvard	GC150TF	Gravação extracelular
Micropipetas de borossilicato	Sutter, Estados Unidos	BF150-86	grampo de remendo
Eletrodo de tungstênio	A-M Systems, EUA	Rolamento 575500
Bomba peristáltica	Mais tempo, China	BT00-300T
Tubos para bomba peristáltica	ISMATEC, Wertheim, Alemanha	SC0309	1x entrada, ID: 1,02 mm
Tubos para bomba peristáltica	ISMATEC, Wertheim, Alemanha	SC0319	2 tubos para vazão, ID: 2,79 mm
Câmera CCD	PCO, Alemanha	pco.edge sCMOS
Papel de limpeza de lentes	Kodak
Tubo de centrífuga cônico de 50 ml	Termocientífico	339652
Pré-câmara	Warner Instruments	BSC-PC
Aquecedor em linha	Warner Instruments	SF-28
Controlador de temperatura	Warner Instruments	TC-324B
Reagentes necessários
NaCl	Reagente químico Sinopharm, China	10019318
Kcl	Reagente químico Sinopharm, China	10016318
KH2PO4	Reagente químico Sinopharm, China	10017618
MgCl2·6H2O	Reagente químico Sinopharm, China	10012818
CaCl2	Reagente químico Sinopharm, China	10005861
NaHCO3	Reagente químico Sinopharm, China	10018960
glicose	Reagente químico Sinopharm, China	10010518
NaH2PO4	Reagente químico Sinopharm, China	20040718
HEPES	sigma	H3375
Piruvato de sódio	sigma	Resposta A4043
MgSO4	Reagente químico Sinopharm, China	20025118
NaOH	Reagente químico Sinopharm, China	10019718