Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Registrando respostas sinápticas em uma câmara de fatia de submersão
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais.
- Pré-aqueça a solução de aCSF em banho-maria a cerca de 28-30 °C (isso evitará a formação de bolhas na câmara de registro).
- Ligue o sistema de reciclagem (4-5 mL/min) e ative o aquecedor em linha para equilibrar o sistema por pelo menos 1 h.
- Mergulhe um pequeno pedaço de papel de limpeza de lentes e uma malha de náilon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de submersão por alguns minutos (Figura 1).
- Remova o fio de platina em forma de U.
- Desligue a reciclagem e coloque uma fatia no papel de limpeza da lente.
- Coloque imediatamente a malha de retenção da fatia em cima da fatia, ligue a bomba e deixe a fatia equilibrar por 30 min sem mergulhar a objetiva no aCSF.
- Encha a micropipeta de borossilicato (ou seja, o eletrodo de registro) com aCSF (resistência da ponta: 1-2 MΩ, preenchida 1/3 com aCSF) e monte-a no porta-pipetas.
- Coloque o eletrodo de estimulação de tungstênio isolado com epóxi testado no suporte do manipulador e os fios de referência na câmara de fatia.
- Adicione um segundo eletrodo de referência à câmara e conecte-o ao soquete de referência do headstage do eletrodo de registro (Figura 1A).
- No ampsoftware de controle do amplificador, clique na caixa "zero clamp mode" e prossiga clicando duas vezes na caixa "lista de ganho de saída". Escolha um ganho de "100", clique duas vezes na "caixa de listagem do filtro passa-alta (Bessel)", escolha "0.1 Hz" e clique duas vezes na "caixa de listagem do filtro passa-baixo (AC)" para escolher "3 kHz".
- No software de gravação, clique em "Adquirir | Escolha um protocolo que tenha configurações que permitam estímulos episódicos e a digitalização de potenciais amplificados em 10-20 kHz por 50-100 ms e que acione automaticamente um isolador de estímulo 10 ms após o início de uma gravação episódica.
- Coloque os eletrodos de estimulação e registro alinhados e paralelos ao estrato piramidal, por exemplo (Figura 1B e Figura 2).
- Clique em "Adquirir | Editar protocolo" e escolha a guia "gatilho" (na janela pop-up). Clique na caixa "fonte do gatilho" e escolha "barra de espaço" como fonte do gatilho. Clique no botão "OK". Clique no botão "gravar" para iniciar a aquisição e observe a janela pop-up com um botão de gatilho.
- No software isolador de estímulo, clique na caixa "voltage controle" e digite "0". Clique no botão "download". Clique na janela "software de gravação" e pressione a barra de espaço. Repita este ciclo inserindo sequencialmente valores de 1 a 8, por exemplo, em passos de 1 mV na caixa "voltage controle".
- Correlacione a força de estimulação com os valores de inclinação de fEPSP e determine a força de estimulação necessária para obter 40% do máximo de inclinação de fEPSP. Clique na "caixa de controle de tensão" e insira o valor determinado. Clique no botão "download".
nota: Um isolador de estímulo é usado para aplicar breves pulsos de tensão ou corrente ao tecido cerebral. Os pulsos bifásicos podem ter 100 μs por fase.
- No software de gravação, clique no botão Parar e depois no menu "Adquirir". Clique em "Editar protocolo" e escolha a guia "gatilho" na janela pop-up. Clique na caixa de fonte do gatilho e escolha o "temporizador interno" como a fonte do gatilho. Clique no botão "OK". Clique no botão de gravação que inicia o registro automático de potenciais de campo a cada 30 s, por exemplo. Clique no botão "parar" após 30-60 min.
- Clique no menu "Adquirir", clique em "Abrir Protocolo", escolha o protocolo de indução desejado de plasticidade sináptica e clique no botão "OK". Clique no botão "gravar" para ativar automaticamente a estimulação e gravação de alta frequência. Clique no botão "parar".
nota: No caso de estudos relacionados à plasticidade sináptica, aplique um dos paradigmas de indução padrão para potenciação de longo prazo ou depressão de longo prazo após registro basal prolongado. Exemplos representativos da modulação resultante da transmissão sináptica são representados na Figura 4 e na Figura 5.
- No software de gravação, clique em "Adquirir | Open Protocol" e escolha o mesmo protocolo da etapa 4.12. Clique no botão "OK" e depois clique em "gravar". Continue executando automaticamente as gravações potenciais de campo por 2-4 h, por exemplo. Clique no botão "parar" para encerrar a gravação.
- No caso de estudos farmacêuticos, aplique o composto diretamente no reservatório de aCSF se for desejada a administração permanente do composto (Figura 3).
