Registros eletrofisiológicos de preparações de tronco encefálico-medula espinhal de um roedor recém-nascido

Resumo

Fonte: Rousseau, J., et al. Eletrofisiologia em preparações isoladas de tronco encefálico-medula espinhal de roedores recém-nascidos permite o registro de saída da rede respiratória neural. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra gravações eletrofisiológicas de preparações isoladas de tronco encefálico-medula espinhal de roedores recém-nascidos. A preparação é colocada em uma câmara de registro e as explosões inspiratórias do tronco encefálico são registradas em condições de oxigenação e privação de oxigênio usando a quarta raiz nervosa ventral na medula espinhal.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Configuração e preparação

1. Soluções
   1. Prepare soluções de estoque de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) de acordo com as seguintes receitas. Outras receitas com variações de concentração estão disponíveis na literatura. Armazene soluções de estoque a 4 °C por até um mês.
      1. Solução salina: adicionar 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH₂PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl₂ (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl₂ (1,26 mM). Dissolver em 800 ml de água destilada e encher até 1 L com água destilada.
      2. Solução de bicarbonato: adicionar 17,65 g de NaHCO₃ (21 mM final). Dissolver em 900 ml de água destilada e encher até 1 L com água destilada. Variações da concentração de bicarbonato resultarão em variações de pH.
      3. Solução de glicose: adicionar 54,06 g de glicose (30 mM final). Dissolver em 400 ml de água destilada e, em seguida, encher até 500 ml com água destilada.
   2. Preparar o aCSF diluindo 100 ml de solução salina, 100 ml de solução de bicarbonato e 50 ml de solução de glucose em 1 L de água destilada. Conservar a 4 °C até à utilização.
   3. Prepare um eletrodo de vidro aquecendo e esticando um tubo de vidro até que ele se quebre. Lixe a ponta antes de usar. O eletrodo pode ser reutilizado muitas vezes, desde que permaneça limpo.
2. Configuração experimental
   nota: Os detalhes da configuração são apresentados na Figura 1.
   1. Ligue o amplificador, a média móvel, o sistema de aquisição de dados, o controlador de temperatura e a bomba. Verifique a amplificação do sinal (ganho = 10.000), a filtragem (limiar baixo, 10 Hz; limiar alto, 5 kHz) e a taxa de amostragem da conversão analógica para digital do sinal bruto (2,5 kHz).
   2. Encha uma garrafa com aCSF e borbulhe com carbogênio (95% O₂, 5% CO₂). Induzir um fluxo de aCSF borbulhado e aquecido na câmara de registo (volume de 5 ml) a 4 ml/min. Mantenha a temperatura na câmara de registro em 26 (± 1) °C. O pH deve ser 7.4 nessas condições padrão.
   3. Mantenha 50 ml de temperatura ambiente (TR) e aCSF borbulhado com carbogênio em uma seringa de 50 ml perto da câmara de dissecação.
   4. Ligue o computador e inicie o software de gravação.

2. Dissecção

1. Pese e determine visualmente o sexo do animal (os machos têm uma distância ano-genital maior, enquanto as fêmeas têm uma distância ano-genital curta; os órgãos genitais masculinos são frequentemente escuros, enquanto os órgãos genitais femininos são rosados).
2. Anestesiar os roedores recém-nascidos com uma das seguintes opções: crioanestesia (mergulhar completamente o animal em gelo por 4 a 5 min), injeção (equitensina a 4 ml/kg) ou inalação de anestésicos voláteis (isoflurano ou éter). Confirme um plano adequado de anestesia pela ausência de um reflexo de retirada da pata.
3. Coloque o animal no banco, com a face ventral voltada para baixo. Corte a parte rostral da cabeça coronalmente com um bisturi no nível do bregma (visível através da pele e do crânio). Execute esta etapa imediatamente após o animal ser anestesiado.
4. Corte o corpo coronalmente com um bisturi sob os membros anteriores.
5. Remova a pele, músculos, tecidos adiposos e vísceras com tesouras e alicates cirúrgicos e finos. Como os ossos são moles nessa idade, tome cuidado para não danificar o sistema nervoso. Execute esta etapa na bancada.
6. Coloque a preparação na câmara de dissecação. Use o aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação. Deste ponto até o final da gravação, use um microscópio.
7. Na face dorsal da preparação, corte o crânio e as vértebras da parte rostral para a caudal ao longo do eixo médio com tesouras e alicates cirúrgicos e finos. Abra o crânio e as vértebras cortados para expor o tecido nervoso. Use o aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação.
8. Com o alicate, remova a membrana aracnóide, um tecido fino que cobre a superfície do tecido nervoso. Retenha a pia-máter e os vasos sanguíneos contra o tecido nervoso. Use o aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação.
9. Coloque a preparação com a dorso voltada para baixo e desça cuidadosamente o tronco encefálico e a medula espinhal, cortando os nervos e o tecido conjuntivo com a tesoura enquanto segura a preparação no lugar. Uma abordagem dorsal também é possível. Mantenha as raízes e os nervos o maior tempo possível. Remova os ossos para isolar o tronco encefálico e a medula espinhal. Use o aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação.
10. Remova o cerebelo e as estruturas rostrais restantes seccionando-as com o bisturi. Use o aCSF armazenado na agulha para oxigenar a preparação.
11. Opcionalmente, dependendo do desenho experimental, remova a ponte com o bisturi por uma seção coronal anterior à artéria cerebelar inferior. Observe que manter a ponte inteira diminuirá o ritmo em ratos e o inibirá totalmente em camundongos. As preparações que incluem apenas a parte caudal da ponte exibem uma atividade semelhante à respiratória com uma frequência estável na raiz de C4.

3. Gravação

1. Coloque a preparação na câmara de registro, com a face ventral voltada para cima. Fixe a preparação com pinos na parte mais baixa da medula espinhal e na parte mais róstral do tronco encefálico.
2. Usando uma seringa ligada ao eletrodo por sua agulha, induza uma depressão no eletrodo (diâmetro da ponta de vidro: 150 - 225 μm) puxando o pistão da seringa, a fim de encher parcialmente o eletrodo com aCSF.
3. Usando um micromanipulador, coloque cuidadosamente o eletrodo próximo a uma das quartas raízes ventrais. Outras raízes ventrais também podem apresentar uma atividade semelhante à respiratória (por exemplo, XII nervo craniano, raiz ventral C1).
4. Induza uma depressão no tanque de eletrodos através da seringa, puxando o pistão para aspirar suavemente a raiz nervosa. Em seguida, mova cuidadosamente o eletrodo para aplicá-lo contra a medula espinhal.
   nota: Idealmente, o tamanho da radícula corresponde ao tamanho da abertura do eletrodo e, assim, cria uma vedação entre os compartimentos interno e externo do eletrodo. Como os amplificadores diferenciais são comumente usados para essas gravações, qualquer abertura entre o interior do eletrodo e a câmara de gravação reduz a qualidade do sinal e dificulta a eliminação do ruído de fundo.
5. Inicie a gravação.
6. Registre o ritmo produzido pela preparação em condições normóxicas (ou seja, aCSF borbulhado com carbogênio: 95% O₂ e 5% CO₂) por pelo menos 20 min para determinar os parâmetros basais da preparação.
7. Mude a perfusão de aCSF com bolhas de carbogênio para estímulo aCSF (ou seja, borbulhou com 95% de N₂ e 5% de CO₂ para estímulo de hipóxia) por 15 min. Altere a duração da exposição dependendo do protocolo experimental. Registre a duração da exposição na ficha técnica do registro e do animal. Use tubos de aço inoxidável entre a garrafa de aCSF e a câmara sempre que possível para evitar a difusão de gás para o exterior do tubo.
8. Mude a perfusão de volta para o aCSF padrão com bolhas de carbogênio por pelo menos 15 minutos para uma gravação de recuperação. Registre isso na gravação e na folha de dados do animal.
9. Encerre a gravação.

Resultados

Figura 1. Esquema recapitulativo da configuração.O aCSF borbulhado é aquecido e enviado por uma bomba na câmara de registro. O excesso de aCSF na câmara de registro é aspirado por uma bomba e descartado. A câmara de registro está ligada ao solo e ao controlador de temperatura. A saída do eletrodo é retransmitida diretamente para o amplificador, depois para a média móvel e o sistema de aquisição de da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Silgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use sob o capô
NaCl	Bioshop	SOD002
Kcl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glicose	Bioshop	GLU501
Carbógeno	Linde	343-02-0006
Controlador de temperatura	Warner Instruments, Hamden, CT, EUA	TC-324B
Eletrodo de sucção	Sistemas AM, Everett, WA, EUA	Modelo 573000
Amplificador CA diferencial	Sistemas AM, Everett, WA, EUA	Modelo 1700
Média móvel	CWE, Ardmore, Pensilvânia, EUA	modelo MA-821
Sistema de aquisição de dados	Dataq Instruments, Akron, OH, EUA	modelo DI-720
Software LabChart	ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA
Software de prisma	Graphpad, La Jolla, CA, EUA
Câmara de gravação	Feito em casa
base	Kanetec, Bensenville, IL, EUA
Micromanipulador	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, EUA	Mb
base	Kanetec, Bensenville, IL, EUA	KITE-R
Bomba peristáltica	Gilson, Middleton, WI, EUA	Mb
Gaiola de Faraday	Feito em casa	MINIPULS 3
computador