Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação Cirúrgica
- Limpe e prepare o transmissor para garantir uma cirurgia segura e estéril. Remova o transmissor de sua embalagem antiestática e borrife ou mergulhe em etanol a 70%. Enxágue o transmissor com solução salina estéril e coloque entre esponjas de algodão estéreis embebidas em solução salina estéril ou mantenha submerso em solução salina estéril.
- Colete e esterilize as ferramentas necessárias para a cirurgia, autoclave a vapor para esterilização. Consulte a tabela de materiais e reagentes para obter a lista de ferramentas cirúrgicas.
2. Implante Cirúrgico
- Anestesiar os animais e manter a anestesia de acordo com o protocolo aprovado pela IACUC. No início e durante a cirurgia, verifique o reflexo de pinça do dedo do pé a cada 15 minutos. A falta de resposta indica nível suficiente de anestesia.
- Para filhotes, use anestesia com isoflurano (4%) com O2 (100%). Para adultos, use cetamina (100 mg / kg) com xilazina (10 mg / kg).
- Posição fixa no quadro estereotáxico. Coloque as pontas da barra auricular no conduto auditivo. Não aperte excessivamente as barras auriculares, pois o crânio é muito macio em filhotes de ratos jovens. Prenda o cone do nariz de anestesia.
- Mantenha o animal aquecido durante a cirurgia, colocando-o na almofada de aquecimento regulada para 37 °C. Em animais adultos, aplique pomada lubrificante nos olhos do animal.
- Esterilize o local da incisão e mantenha o campo cirúrgico estéril.
- Esfregue o couro cabeludo com aplicações alternadas de etanol 70% e betadina. Comece no centro do couro cabeludo e faça círculos concêntricos cada vez mais largos.
- Cubra o animal com cortinas e faça a cirurgia sobre o animal drapeado. Mantenha o campo cirúrgico estéril revestindo a configuração cirúrgica com campos estéreis, pulverize o equipamento com etanol a 70%.
- Use luvas cirúrgicas estéreis e um avental (ou conforme exigido pela instituição). Para ajudar a manter um campo estéril, use um assistente cirúrgico.
- Faça uma incisão no couro cabeludo do animal ligeiramente atrás dos olhos ao longo da linha média, aproximadamente 2 cm. Tenha cuidado ao inserir o bisturi, pois o crânio ainda é muito macio em filhotes de ratos jovens. Faça um único corte para que a incisão sangre menos e cicatrize mais rápido.
- Exponha o crânio. Prepare uma área limpa e seca para maximizar a ligação entre o transmissor e os ossos do crânio. Use clipes de aneurisma para agarrar o couro cabeludo.
- Puxe suavemente o couro cabeludo para longe da linha média nos quatro cantos. Procure pontos de referência anatômicos, como bregma e lambda no crânio. Lembre-se de que os ossos do crânio não são fundidos em animais nessa idade. Use o atlas de coordenadas estereotáxicas de Paxinos para encontrar a localização correta para o buraco da rebarba.
- Use uma ferramenta do tipo Dremel com uma broca do tipo rebarba. Crie dois furos de rebarba nas posições de gravação desejadas com os furos maiores que 300 μm de diâmetro. Coloque o orifício da broca para o eletrodo de referência sobre o cerebelo atrás da lambda do crânio.
- Certifique-se de que os fios do transmissor estejam alinhados com os orifícios das rebarbas. Se os fios do eletrodo não estiverem alinhados, é provável que haja contaminação por cola dos eletrodos e resultará em sinal ruim. Para alinhar os fios, verifique o ajuste do transmissor e dobre suavemente os eletrodos para alinhar sobre os locais pretendidos para os orifícios de rebarba.
- Apare os cabos do eletrodo. Use uma tesoura cirúrgica para aparar os eletrodos no comprimento desejado. A profundidade do eletrodo é importante para o tipo de gravação necessária para o experimento (ou seja, coloque os eletrodos acima da dura-máter para gravações de EEG ou use coordenadas estereotáxicas para estruturas cerebrais definidas).
- Aplique generosamente cianoacrilato na base do transmissor para cobrir a área, certificando-se de evitar o revestimento dos eletrodos. A cola de cianoacrilato é um isolante elétrico, contaminando eletrodos com cola
- Se estiver gravando de estruturas cerebrais profundas, monte o transmissor no suporte da cânula e coloque-o no braço estereotáxico para controle do eixo z. Abaixe o transmissor usando o braço estereotáxico até a profundidade apropriada e coloque o gel de cianoacrilato ao redor do transmissor.
- Seque completamente o crânio antes de colocar o transmissor para garantir uma forte ligação adesiva. Aplique transmissor revestido com cianoacrilato no crânio. Tome cuidado para alinhar os eletrodos com os orifícios de rebarba correspondentes.
- Tente evitar danificar as principais estruturas vasculares. Segure o transmissor no lugar com uma leve pressão por um minuto. Use uma leve pressão para formar uma forte ligação entre o transmissor e o crânio.
- Aplique cianoacrilato adicional, o suficiente para selar completamente a interface transmissor/crânio. Para garantir um bom ajuste e uma ligação forte, maximize a área de superfície da cola que entra em contato com o crânio. Aplique o adesivo de cianoacrilato em um círculo ao redor do transmissor, certificando-se de que o crânio e a parede do transmissor estejam cobertos.
- Aplique acelerador químico (0,1 ml) através de uma seringa ao redor do cianoacrilato na base do transmissor implantado. Use o acelerador com moderação, tomando cuidado para não aplicar no tecido adjacente.
nota: A aceleração química da cura do cianoacrilato garante que a forte ligação entre o transmissor e o crânio seja formada rapidamente. O acelerador de cianoacrilato é útil para acelerar a cura do adesivo, mas não é necessário.
- Remova o acelerador lavando bem a área com solução salina estéril. O acelerador de cianoacrilato pode causar irritação nos tecidos se não for lavado da área da incisão. Para lavar a área, encha uma seringa de 1,0 ml com solução salina estéril e irrigue a área com uma agulha de seringa. Geralmente, 0,5 ml de solução salina é suficiente para lavar o acelerador.
- Suture a pele ao redor da base do transmissor, mas não cubra o transmissor. A parte superior do transmissor deve estar acima da pele para transmitir sinais neurais com eficiência. A pele deve estar razoavelmente apertada ao redor do transmissor e a cola ao redor da unidade. Use Vicryl ou sutura de seda (fio macio); A pele dos animais imaturos é macia e pode ser facilmente danificada se não forem utilizadas suturas moles. Para animais adultos, use qualquer material de sutura.
- Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque sobre um cobertor aquecido para recuperação.
- Certifique-se de que os animais estejam aquecidos (37 °C) e ambulatoriais (ou seja, completamente recuperados) antes de retornar à barragem. Certifique-se de que o animal esteja hidratado beliscando a pele nas costas do animal (se o animal estiver desidratado, a pele permanecerá deformada). Se o animal estiver desidratado, administrar injeção subcutânea de tampão de Ringer com lactato. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) aos animais para controle da dor pós-cirúrgica e uma injeção subcutânea de 0,1 ml de bupivacaína ao redor do local da injeção.
nota: Do início ao fim, todo o procedimento deve ser concluído em 5-10 minutos para animais dessa idade (dia 6 pós-natal). O tempo cirúrgico pode levar mais tempo para animais mais velhos.
3. Cuidados e Moradia
Nota: Algumas barragens podem não tolerar filhotes implantados com o dispositivo. Pode ser necessário selecionar barragens que sejam tolerantes. É aceitável que a barragem mova os filhotes pela gaiola, pegando-os pelo transmissor.
- Depois que os animais forem desmamados, abrigue-os individualmente para evitar a remoção dos dispositivos de seu companheiro de gaiola.
- Eutanasiar animais com dose letal de pentobarbital (25 mg/kg) ou isoflurano (em uma redoma de vidro) quando houver sinais de sofrimento.
- Nota: algumas gaiolas de alojamento de animais com inserções de arame podem interferir nos transmissores implantados. Certifique-se de verificar a altura da inserção do fio para garantir que os animais não consigam prender o transmissor entre as 'barras' da inserção do fio.
4. Gravação de EEG
- Coloque o animal em uma gaiola sozinho ou co-alojado com irmãos de ninhada e a mãe. No entanto, coloque apenas um animal implantado em uma única gaiola. Não deixe os filhotes sozinhos na câmara de gravação por mais de 2 horas. Monitore os animais em busca de sinais de angústia e desidratação.
- Conecte a fonte de alimentação fornecida à base do receptor e verifique se a luz de alimentação está acesa. Conecte a base do receptor a um sistema de aquisição de dados usando cabos Bayonet Neil-Concelman (BNC).
- Coloque a gaiola do animal em cima da base do receptor (Figura 1). A luz de "sinal" deve acender indicando que um transmissor foi detectado. Os dados agora podem ser registrados.
- Para gravar dados, conecte a base do receptor a um conversor analógico-digital e conecte o conversor a um computador (Figura 2).
- Defina a taxa de amostragem da gravação. Verifique se os dados são amostrados corretamente. Selecione pelo menos 250 Hz samptaxa (500 Hz recomendado) para gravação (a largura de banda do transmissor é de 0.1-100 Hz).
- Salve dados digitalizados e analise usando pacotes de software de processamento de sinais, como o Matlab.
