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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Configuração para cortar fatias de cérebro
- Prepare uma solução de corte composta por (mM) 125 Colina-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glicose saturada com gás carbógeno (95% O2–5% CO2) e uma solução de registro de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) composta por (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glicose, saturada com carbogênio. Coloque a solução de corte no gelo para mantê-la fria.
- Congelar cerca de 400 ml da solução de corte e misturar com 100 ml de solução de corte não congelada para criar uma pasta de gelo. Borbulhar com carbogen (95 % O2–5 % CO2) a um fluxo de aproximadamente 0,5 L/min através de tubos de pequeno calibre ou vidro sinterizado para produzir um fluxo constante, mas suave, de bolhas.
- Prepare um copo de 250 ml com uma inserção de malha de náilon em relevo sobre a qual serão colocadas as fatias de miolo. Encher com aCSF para cobrir a malha em cerca de 2 cm e borbulhar com carbogénio, garantindo que as bolhas não perturbem directamente a área de retenção da fatia. Também é importante que não haja bolhas de ar na malha de náilon, portanto, se houver, remova-as. Esta será a câmara de retenção e é mantida em RT (20 - 25 °C).
- Disponha os instrumentos de dissecação, incluindo uma tesoura grande, uma tesoura pequena, micro espátulas pequenas e grandes e pares grandes e pequenos de pinças e resfrie-os no gelo. Coloque o bloco de corte de tecido vibratomo no gelo em um quadrado de papel alumínio. Obtenha 2 pedaços de papel de filtro de 6 cm, uma lâmina de barbear de ponta única e um copo de 25 ml cheio também com a pasta da solução de corte.
- Encha um segundo recipiente com gelo, coloque um pedaço de papel de seda sobre o gelo e coloque uma placa de cultura de 12 cm por cima. Encha o prato de cultura com solução de corte, pasta de gelo e borbulhe com carbogênio. Este é o recipiente em que a dissecção cerebral será realizada.
- Prepare o vibratome. Remova uma lâmina de barbear nova de dois gumes (use uma lâmina nova todas as vezes) de sua embalagem e borrife com etanol a 80% e depois com água deionizada. Corte uma pipeta de transferência de plástico de 3 ml no ponto em que começa a afunilar. Isso será usado para transferir fatias de cérebro. Dobre uma agulha de 27 G na base em aproximadamente 45° e coloque em uma seringa de 1 ml. Isso será usado para manipular fatias durante o corte.
2. Cortando fatias de cérebro
- Anestesiar um camundongo (P16-P18) com isoflurano a 2% ou um método aprovado localmente. Após a indução, decapite o animal com uma tesoura grande e deixe cair a cabeça na placa de cultura de 12 cm que contém pasta de solução de corte borbulhada. A pasta deve imergir totalmente a cabeça para um resfriamento rápido.
- Segure a frente da cabeça com uma mão, descascando a pele e o tecido conjuntivo para a frente em direção ao nariz. Usando a pequena tesoura, corte o tecido conjuntivo para revelar o crânio subjacente. Em seguida, remova os músculos que recobrem o aspecto dorsal do crânio e pescoço.
- Remova o cérebro do crânio prendendo primeiro a frente do crânio com a pinça grande e, em seguida, faça dois cortes laterais no osso de cada lado do forame magno usando a tesoura pequena (Figura 1, cortes rotulados como A1 e A2).
- Faça outro corte entre os olhos (logo anterior ao bregma) (Figura 1, corte rotulado como B) e, em seguida, corte cuidadosamente ao longo da sutura sagital anteriormente e reflita as seções cortadas do crânio para revelar o cérebro (Figura 1, corte rotulado C).
- Use a pequena espátula para retirar o cérebro e coloque em um prato de cultura. Esteja ciente dos nervos cranianos no aspecto inferior do cérebro que precisarão ser cortados, isso pode ser feito usando a micro espátula de tamanho menor. Transferindo o cérebro para o copo de 25 ml cheio da pasta da solução de corte, utilizando a espátula maior.
- Preparando o hemisfério cerebral para fatiar.
- Coloque um pedaço de papel de filtro de 6 cm no fundo de uma placa de cultura fresca e encha com uma pasta de solução de corte fresca e borbulhas. Use a espátula maior para posicionar o cérebro, com o lado ventral voltado para baixo, no papel de filtro. Pegue uma lâmina de barbear nova e limpa e corte o cérebro para remover o cerebelo, depois faça um corte ao longo da linha média para separar o cérebro em dois hemisférios.
- Preparando o bloco de tecido vibratomo.
- Pegue o bloco de tecido vibratomo resfriado, seque a superfície e coloque uma gota de cola de cianoacrilato no meio e espalhe uniformemente até o tamanho aproximado do cérebro. Use a pequena espátula para manipular um dos hemisférios cerebrais na grande micro espátula de modo que o lado medial do cérebro fique para baixo.
- Toque a borda da espátula na interface do cérebro no segundo pedaço de papel de filtro para remover o máximo possível da solução. Deslize o cérebro para fora da espátula maior usando a espátula menor para guiá-lo sobre a cola.
- Prenda o bloco de corte na câmara do vibratomo e encha a câmara com pasta e bolha da solução de corte, garantindo que o cérebro esteja completamente imerso. Gire o bloco de corte de forma que o lado ventral do cérebro fique voltado para a lâmina.
- Fatiando o cérebro.
nota: Cada vibratomo é único, portanto, siga as instruções do fabricante.
- Defina a espessura da fatia para 450 μm e certifique-se de que a lâmina esteja vibrando à medida que se move pelo cérebro a uma velocidade de aproximadamente 0,3 mm/s. Corte inteiramente através do cérebro do lado ventral até a superfície cortical, isso produzirá fatias sagitais de todo o cérebro que podem ser usadas para registros eletrofisiológicos. As fatias serão produzidas lateralmente a medialmente e normalmente 3 a 4 fatias podem ser cortadas de cada hemisfério.
- Se a base da fatia levantar, use a agulha dobrada de 27 G para pressionar suavemente a fatia de volta para baixo. À medida que cada fatia é cortada, use a pipeta de transferência para movê-la para a plataforma na câmara de retenção, onde são viáveis por até 8 horas.
3. Registros de eletrofisiologia extracelular
- Montagem da fatia na câmara de gravação.
- Utilizando a pipeta de transferência, colocar uma fatia de cérebro numa câmara de registo submersa, perfundida com aCSF a 1 - 2 ml/min e aquecida a 32 °C. O aCSF usado para registros difere daquele na câmara de retenção, pois a concentração de Mg2+ é aumentada de 2 mM para 4 mM.
- Prenda a fatia com uma "harpa" (aço inoxidável semicircular com fios de náilon esticados em espaçamento de 2 a 3 mm). Coloque a harpa de forma que os fios fiquem paralelos ao CA1. Aumente a velocidade da perfusão para 8 - 10 ml/min a 32 °C.
- Sob um microscópio de dissecação, coloque um eletrodo estimulante e um eletrodo de registro (eletrodo de vidro preenchido com a solução de registro de aCSF) na superfície do estrato radiado do CA1 (Figura 2A). Coloque o eletrodo de estimulação primeiro e, em seguida, coloque o eletrodo de gravação.
- Estimule as colaterais de Schaffer com uma amplitude de 120 - 150 μA e pulso de teste de duração de 0,1 ms e observe a forma de onda do potencial pós-sináptico excitatório de campo resultante (fEPSP) para determinar a saúde do corte (Figura 2B). Os eletrodos de estimulação e gravação podem precisar ser movidos para a fatia a aproximadamente 50 - 100 μm da superfície da fatia para obter uma gravação fEPSP com um pequeno voleio de fibra e grande amplitude. Os fEPSPs evocados colaterais de Schaffer são estereotipados e fornecem um bom indicador da saúde da fatia. Fatias saudáveis normalmente mostram uma proporção de amplitude de voleio de fibra para fEPSP inferior a 0,3.
- Reposicionamento dos eletrodos.
- Usando um microscópio de dissecação, mova o eletrodo estimulante para o meio do estrato oriens e mova o eletrodo de registro para a camada de células piramidais o mais próximo possível do eletrodo de registro, conforme mostrado na Figura 3A. Os eletrodos de estimulação e registro podem precisar ser empurrados para dentro da fatia aproximadamente 50 - 100 μm para que a amplitude de resposta fEPSP ao pulso de teste de 120 - 150 μA seja de aproximadamente 1 mV.
- Gerando oscilações γ.
- Para gerar oscilações γ, estimule o tecido com um trem de pulsos de 20 x 0,1 ms entregues a 200 Hz. Esse estímulo tetânico pode produzir respostas reprodutíveis quando administrado a cada 5 minutos.
- Use os seguintes parâmetros de gravação.
- Dimensione o ganho do sinal de saída para corresponder à faixa de tensão de entrada do conversor analógico-digital. Certifique-se de que a excursão máxima esperada do sinal use um mínimo de 30% da faixa de tensão de entrada. Tenha cuidado ao definir ganhos muito altos, pois os sinais podem ser cortados. A largura de banda típica necessária para gravações de campo é de 500 Hz com acoplamento CA a 0,1 Hz para remover o desvio da linha de base.
- Digitalize pelo menos 4 a 5 vezes mais rápido do que a frequência de canto do filtro passa-baixo para evitar aliasing de sinal.
