Registro de eletrorretinograma acoplado direto do epitélio pigmentar da retina em um camundongo

Resumo

Fonte: Miyagishima, K. J., et al. Eletrorretinograma de acoplamento direto (DC-ERG) para registrar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmentar da retina do camundongo. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a gravação de um eletrorretinograma de acoplamento direto (DC-ERG) em um epitélio pigmentar da retina (EPR) de camundongo anestesiado e adaptado ao escuro. Após a aplicação de gotas dilatadoras, o animal é colocado em uma configuração de gravação e o eletrodo capilar preenchido com um tampão de sal é colocado na córnea. Depois de estabelecer a linha de base, o DC-ERG é registrado.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Posicionamento do mouse e do eletrodo

1. Mantenha os ratos durante a noite em uma caixa bem ventilada e à prova de luz para adaptação ao escuro.
2. Os animais foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg).
3. Aplique uma gota de HCl de proparacaína a 0,5% topicamente para anestesiar a córnea, bem como uma gota de HCl de fenilefrina a 2,5% e tropicamida a 0,5% para dilatar as pupilas.
4. Apare os bigodes do mouse com uma tesoura para evitar que espasmos inadvertidos perturbem os eletrodos capilares de vidro durante a gravação.
   nota: O protocolo de estímulo de eletrorretinograma acoplado direto (DC-ERG) dentro do sistema ERG possui várias rotinas de estímulo integradas que podem ser selecionadas clicando no Passo (seta para frente) ou Passo (seta para trás). Apenas as etapas 1, 4 e 5 do software são necessárias para preparar e executar a gravação DC-ERG.
5. No sistema ERG, o software verifica se o paciente correto foi selecionado. Clique no botão verde Protocolos. Em Descrição do protocolo, selecione DC-ERG. Em seguida, clique em Executar. Verifique se este é o teste correto que está sendo realizado clicando em Sim.
6. Use o estímulo de luz vermelha designado da Etapa 1/6 para acender a luz vermelha dentro da cúpula para ajudar a posicionar o mouse e os eletrodos enquanto observa as mudanças na impedância.
7. Coloque o mouse em uma mesa de gravação aquecida e cuidadosamente cubra a pele da perna traseira usando uma pinça. Segure o eletrodo da agulha firmemente em uma mão e insira-o subcutaneamente na perna traseira para prendê-lo no lugar.
8. Coloque o eletrodo de referência Silver/Siverchloride(Ag/AgCl) (Tabela de Materiais) dentro da boca para que o pellet sinterizado fique ao longo da bochecha posterior e seja mantido no lugar atrás dos dentes.
   nota: Os eletrodos de fio de ouro não devem ser usados como eletrodo de referência da boca, pois têm características de impedância diferentes e aumentam o ruído pico a pico.
9. Antes de colocar os eletrodos capilares no olho do mouse, segure o porta-eletrodo com os capilares de vidro verticalmente e mova o porta-eletrodo com o dedo indicador para remover quaisquer bolhas que possam ter sido introduzidas. Encha a ponta com a solução salina balanceada de Hanks (HBSS) usando uma agulha de 25 G presa a uma seringa e inspecione para garantir que não haja bolhas de ar presas na ponta. Posicione o suporte do suporte do eletrodo de forma que a ponta aberta dos capilares preenchidos com HBSS fique em contato suave com a córnea.
10. Tenha precauções especiais para evitar a introdução de bolhas de ar, segurando o dispensador de gel lubrificante para os olhos invertido e descartando as gotas iniciais. Coloque uma gota de gel lubrificante para os olhos em cada olho para manter a condutividade e evitar a dessecação durante a gravação.

2. Gravação DC-ERG

1. Clique em Etapa (seta para frente) para selecionar Etapa 4/6 "Long Flash No-Li".
2. Clique em Impedância. Use a tela Verificação de impedância para examinar as resistências dos olhos esquerdo e direito. Espera-se que os valores de impedância para os eletrodos de registro em cada olho sejam semelhantes (~ 39 kΩ). Espera-se que os valores de impedância para o aterramento e os eletrodos de referência sejam inferiores a 10 kΩ).
3. Clique em Visualizar para ver os traços do olho esquerdo e direito. Aguarde até que uma linha de base estável seja alcançada (<10 min). Clique em Parar para sair da visualização do rastreamento.
   nota: Mudanças abruptas na direção do desvio ou ruído aberrante na gravação não melhorarão com o tempo e exigirão a identificação do eletrodo capilar que precisa de atenção. A causa mais provável é uma bolha introduzida na ponta do eletrodo. Reabasteça a ponta com HBSS. Clique em Visualizar novamente para verificar a linha de base.
4. Clique em Passo (seta para frente) para selecionar Passo 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min." Clique em Executar para iniciar a gravação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Eletrodo Ag/AgCl (boca)	WPI Inc	EP1	Eletrodo de referência de boca para mouse
Telha cerâmica	Instrumento Sutter	CTS	Usado para cortar o tubo capilar de vidro para um tamanho apropriado
Vara de limpeza com ponta de algodão	Produtos Médicos Puritanos	867-WC Sem Cola	Para ser usado como espaçador para melhorar o ajuste do conjunto do porta-eletrodo
Sistema de eletrorretinograma (ERG)	Diagnóstico LLC	Sistema E3	Sistema de eletrofisiologia visual para diagnosticar condições oftálmicas em pesquisas de visão e testes de medicamentos
bico de Bunsen	Argos Technologies	BW20002460	Ou equivalente a moldar vidro sob chama
Tubo capilar de vidro (1,5 mm)	Instrumentos Sutter	BF150-75	Para preenchimento com HBSS e contato com a córnea
Solução salina tamponada de Hank (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Disponível comercialmente. Manter em RT
Filtro em linha	O que homem	Nº 6722-5001	Para proteger a bomba de vácuo de aerossóis
Cabo de baixo ruído para suportes de microeletrodos	WPI Inc	Rolamento 5372	Sugerido para melhorar o comprimento e a colocação dos cabos e conjuntos de suportes de eletrodos
Junta esférica magnética	WPI Inc	500871	Para posicionar magneticamente o conjunto do suporte do eletrodo na platina
MatLab	Obras matemáticas		MatLab: Para editar o software de análise
Caixa de ferramentas Matlab Curvefit	Obras matemáticas		Caixa de ferramentas para MatLab (necessária apenas para editar o software de análise)
Compilador MatLab	Obras matemáticas		Caixa de ferramentas para MatLab (necessária apenas para editar e relançar o software de análise)
MatLab Runtime versão 9.5	Obras matemáticas	R2018b (9.5)	Necessário para executar o software de análise: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Suportes de microeletrodos (45 graus)	WPI Inc	MEH345-15	Para segurar os capilares
Agulha (25 ga)	Covidien	8881250313	Para encher os tubos capilares com HBSS
eletrodo de agulha (terra)	Link de ritmo	13mm - um elctrodo	Eletrodo de agulha subdérmica (terra) para camundongo (13 mm de comprimento, agulha de 0,4 mm de diâmetro, fio condutor de 1,5 m)
Regulador/condicionador de energia	Furman	Pág. 1800	Ou equivalente para remover o deslocamento CC do ruído introduzido pela linha de energia
Seringa (12 mL)	Monoject	1181200777	Para encher os tubos capilares com HBSS
Clipe em T	Cole-Parmer	06852-20	Para montagem de porta-eletrodos
Dessecador a vácuo	Bel-Art	Nº 420120000	Fundo e tampa de policarbonato transparente
Tratamento farmacológico
Gel lubrificante para os olhos	Alcon	Telefone: 0078-0429-47	Ajuda a lubrificar a superfície da córnea e a manter contato elétrico com eletrodos capilares
Cloridrato de fenilefrina 2,5%	Akorn	17478-201-15	Colírio midriático de ação curta (para dilatação da pupila)
Cloridrato de proparacaína 0,5%	Akorn	17478-263-12	Anestésico local para instilação oftálmica
Tropicamida 0,5%	Akorn	17478-101-12	Colírio midriático de ação curta (para dilatação da pupila)
xilazina	Analisado	sc-362949Rx	Analgésico e relaxante muscular
Cetamina (Cetamina HCl)	VetOne	501072	Anestésico para injeções intramusculares