Registros eletrofisiológicos de Drosophila Sensilla em resposta a odores voláteis

Resumo

Fonte: Ng, R., et al. Registro eletrofisiológico de Drosophila Trichoid sensilla em resposta a odores de baixa volatilidade. J. Vis. Exp. (2017).

Neste vídeo, uma mosca Drosophila viva é montada em um tubo para estudos eletrofisiológicos. Os eletrodos são posicionados na base do sensillum para registrar respostas neuronais específicas aos feromônios com os neurônios receptores olfativos da mosca.

Protocolo

1. Preparação do hardware para gravação at4

1. Use um instrumento extrator de pipeta para preparar eletrodos com capilares de vidro de aluminossilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Ventile levemente a ponta do eletrodo de referência com um par de pinças finas para facilitar a inserção no clípeo da mosca (ou seja, uma placa arredondada na frente da cabeça da mosca, acima das peças bucais).
   NOTA: Machos WT (tipo selvagem) (Berlin) de 7 dias de idade foram usados neste estudo. Use solução salina AHL como eletrólito para ambos os eletrodos.
2. Prepare 1 L de AHL (Adult Hemolymph-Like) misturando 900 mL de água destilada com 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO₃, 0,1120 g de NaH₂PO₄, 1,892 g de Trealose ּ2H₂O, 3,423 g de sacarose, 1,192 g de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico), e 8,2 mL de MgCl_{1M 2}. Usando água destilada, aumente o volume total para 1 L. Traga o pH para 7,4 usando NaOH 1 N e esterilize a solução com um sistema de filtro acionado a vácuo. Para armazenamento de longo prazo, manter as alíquotas AHL a 4 °C.
   NOTA: Entregas consistentes de ácido palmitoleico dependem da uniformidade entre os cartuchos. Cada cartucho deve ser montado de maneira reprodutível.
3. Usando uma lâmina de barbear, remova 0,9 cm da ponta de uma ponta de pipeta de 200 μL para criar a primeira seção do cartucho, medindo 4,1 cm; consulte as dimensões detalhadas na Figura 1A. Use outra ponta de pipeta de 200 μL e remova 1,7 cm e 1,5 cm da ponta e da base para criar a segunda seção do cartucho, medindo 1,8 cm (Figura 1A). Use uma régua para garantir a reprodutibilidade.
4. Use um furador de 1/8" para cortar discos de papel de filtro.
5. Use uma pinça para colocar um disco de papel de filtro na ponta da segunda seção do cartucho. Confirme visualmente uma abertura na ponta do cartucho através da qual o ar pode passar.
6. Prenda a primeira e a segunda seções do cartucho, conforme mostrado na Figura 1A. Incline a segunda seção do cartucho para baixo para facilitar a mira quadrada na preparação (Figura 1B).
7. Conecte o cartucho com o tubo de liberação de odor montado em um micromanipulador.
   NOTA: Este design permite que o cartucho seja girado para fora para facilitar a troca (Figura 1C).
8. Defina o fluxo de ar umidificado constante para 2 L/min em um controlador de massa e o fluxo de odor para 500 mL/min em outro controlador de massa.
9. Usando o software (consulte a Tabela de Materiais), programe o procedimento para administrar um sopro de odor de 500 ms.

2. Preparação de soluções de odor de ácido palmitoleico para entrega

NOTA: Os ORNs Or47b respondem ao ácido cis e trans-palmitoleico. Como o ácido palmitoleico é instável à RT, as existências são armazenadas a -20 °C e utilizadas no prazo de um mês após a abertura. O etanol é o solvente de escolha para o ácido palmitoleico.

1. Use um misturador de vórtice para misturar completamente 10 μL de estoques ou diluições de ácido cis ou trans-palmitoleico com 90 μL de etanol 100% para diluições seriadas dez vezes maiores em microtubos de 1,7 mL. Preparar diluições frescas de ácido palmitoleico diariamente antes dos experimentos e usar dentro de um dia.
   NOTA: Um frasco de vidro é recomendado para odores não solúveis em etanol para preparar diluições de odor com outros tipos de solventes orgânicos.
2. Usando uma micropipeta P10, aplique 5 μL de soluções de ácido cis-palmitoleico das diluições desejadas no papel de filtro em cada cartucho correspondente.
   NOTA: A dosagem mais alta (^10-1) contém 450 μg do composto. Para soluções de ácido trans-palmitoleico, aplique 4,5 μL para que a dosagem mais alta (^10-1) contenha 450 μg do composto.
3. Coloque os cartuchos de ácido palmitoleico em um dessecador a vácuo por 1 h a RT e 7,59 mmHg de pressão para evaporar completamente o solvente.
   NOTA: Os cartuchos podem ser usados por até 4 h em RT.

3. Preparação de Drosophila para Pronto Acesso ao at4 Sensilla para Gravações Eletrofisiológicas In Vivo

NOTA: As moscas WT (Berlim) são criadas em meio de fubá padrão a 25°C em um ciclo claro-escuro de 12:12. Após a eclosão, as moscas são separadas por sexo em grupos de dez, onde são alojadas em grupo até os 7 dias de idade. Or47b ORNs (neurônios receptores olfativos) em moscas machos e fêmeas respondem ao ácido palmitoleico. Para simplificar, apenas moscas machos são examinadas no estudo atual.

1. Monte uma lâmina de preparação de mosca: em uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula de vidro (18 x 18 mm2) em uma pequena quantidade de massa de modelar, formando um ângulo de ~ 3° com a lâmina de vidro. Coloque fita dupla-face na borda interna da lamínula e na área do slide imediatamente abaixo. Substitua por uma fita nova para cada dia de gravação (Figura 2A).
2. Use um aspirador de moscas15 para coletar a mosca de interesse no tubo e, em seguida, encaixe uma ponta de pipeta de 200 μL sobre a extremidade do tubo. Simultaneamente, mova o tubo para frente enquanto sopra ar nele para empurrar a mosca até o final da ponta da pipeta. Use uma lâmina de barbear para cortar logo abaixo do corpo da mosca e 2 comprimentos de cabeça acima da mosca.
3. Aperte a parte inferior da ponta da pipeta com massa de modelar, empurrando a mosca para cima até que as antenas e o clípeo fiquem expostos (Figura 2B). Para evitar matar a mosca, adicione apenas argila suficiente para expor as antenas e aristas, pois isso evita que o abdômen da mosca seja esmagado. Além disso, adicione argila lenta e suavemente para evitar qualquer constrição repentina. Confirme se a mosca está viva verificando o movimento da antena ou da tromba.
4. Use uma pinça para manobrar a ponta da pipeta que abriga a mosca. Oriente a cabeça de forma que o clípeo fique voltado para a direita do observador. Ajuste a preparação ao longo da lamínula usando uma pinça fina até que o lado lateral da antena fique encostado na superfície da lamínula com fita adesiva (Figura 2B).
5. Coloque uma haste de fixação no arista para prender a antena à fita dupla-face para evitar movimento (Figura 2B).
   NOTA: A haste de retenção é puxada de um capilar de vidro borossilicato com um extrator de pipeta e mantida na posição com massa de modelar (Figura 2A).
6. Coloque a preparação no estágio da plataforma (Figura 2C). Usando o microscópio, confirme se o tricoide é visível ao longo da borda distal-lateral do terceiro segmento da antena.
   NOTA: A sensila deve ser recortada contra o fundo, simplificando sua identificação e facilitando o registro (Figura 3). Nesta preparação, as sensilas tricóides mais acessíveis são do tipo at4.
7. Conforme descrito anteriormente, 2, 15, mantenha a preparação sob fluxo de ar umidificado constante (2 L/min) fornecido por meio de um tubo de fornecimento de ar separado a cerca de 2 cm da preparação (Figura 4).

4. Registro da atividade de at4 Sensillum de ORNs Or47b nos tricoides at4 em resposta ao ácido palmitoleico

1. Insira o eletrodo de referência no clípeo (Figura 3A). Com um movimento rápido e suave, certifique-se de que o eletrodo seja inserido logo abaixo da superfície, onde possa entrar em contato com a hemolinfa sob a cutícula para evitar danos aos tecidos.
2. Abaixe o eletrodo de gravação lentamente até que ele entre no mesmo view plano que o sensillum alvo (Figura 3B). Grave sob uma lente objetiva 50X.
   nota: A cutícula tricoidal resistente requer a inserção do eletrodo de registro na base sensilar, cuja área mais ampla fornece um alvo maior que reduz a probabilidade de o eletrodo ser desviado (Figura 3B, inserção).
3. Antes de aplicar estímulos de odor a um sensillum, observe os seguintes critérios de seleção: qualquer tricóide que não atenda a esses padrões deve ser rejeitado e outro sensillum deve ser escolhido.
   1. Observe uma alta relação sinal-ruído (consulte a Figura 3C para obter um exemplo).
   2. Observe picos identificáveis dos neurônios at4A e at4C (Figura 3C).
      NOTA: A amplitude do pico at4B parece muito semelhante à at4A10 e não pode ser identificada facilmente sem estimulação de odor.
   3. Observe que a taxa de disparo basal dos neurônios at4A está em torno ou abaixo de 20 Hz.
      NOTA: Este critério é específico para at4A porque a taxa de disparo basal para o neurônio é maior do que a dos ORNs basicônicos. Um disparo basal muito mais alto indica que os neurônios podem ter sido danificados durante a inserção do eletrodo.
4. Conecte o cartucho ao tubo de entrega de odor. Comece com o controle de solventes e depois com os odores, de baixas a altas concentrações. Use o micromanipulador para manobrar o cartucho em direção à preparação enquanto aponta o cartucho diretamente para a cabeça da preparação. Confirme visualmente se o cartucho está apontado diretamente para a antena (Figura 4) a alguns milímetros de distância.
   NOTA: O objetivo é orientar a abertura do cartucho diretamente na antena e posicioná-lo próximo ao tecido alvo.
5. Certifique-se de que o cartucho de odor esteja separado do eletrodo de gravação à sua direita em 1 - 2 mm e da lâmina de preparação da mosca abaixo em aproximadamente 1 mm.
   nota: Na configuração descrita aqui, o cartucho de odor é cercado pelo eletrodo de gravação, o eletrodo de referência e a lâmina de preparação da mosca (Figura 4).
   NOTA: Considere a distância entre o cartucho e os eletrodos de gravação/referência. Recomenda-se uma distância de cerca de 4 mm. O contato não intencional pode encerrar o sinal e quebrar a ponta do eletrodo de registro, danificando o neurônio atual e complicando os registros futuros.
   NOTA: Considere a distância que separa o cartucho e a corrediça de preparação da mosca. Tocar na lamínula também pode desalojar o eletrodo de gravação, interrompendo a gravação.
6. Pressione "Gravar" no software de aquisição de dados para iniciar a gravação.
   NOTA: Para cada gravação de 10 s, um único pulso de odor de 500 ms é fornecido diretamente à antena, conforme descrito na etapa 1.9.
7. Depois que o odorante for aplicado, retraia cuidadosamente o cartucho antes de substituí-lo por um cartucho da próxima concentração mais alta. Continue até que toda a faixa de dosagem seja obtida.
   NOTA: Recomenda-se que apenas um ORN Or47b seja registrado de cada mosca para evitar possíveis efeitos de adaptação.
8. Enxágue bem o eletrodo de gravação com água destilada após terminar a gravação do dia.
9. Analise e plote os dados usando um software de análise off-line disponível comercialmente.

Resultados

Figura 1: Configuração do cartucho e do olfatômetro. (A) Preparação de cartuchos de odor. Da esquerda para a direita: uma ponta de pipeta padrão de 200 μL, a primeira e a segunda seções do cartucho e um cartucho de odor completo. (B) O cartucho conectado ao olfatômetro, mostrando a inclinação para baixo da segunda seção. (C) Configuração do olfatômetro representando o tubo de liberação de odor montado no micromanipul...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Configuração de Preparação & Materiais Diversos
Instrumento extrator de pipetas	Instrumentos Sutter, Novato, CA, EUA	Pág. 97	Extrator de pipetas
Capilares de vidro borossilicato	Instrumentos de precisão do mundo, Sarasota FL EUA	1B100F-4	para fazer hastes de retenção
Capilares de vidro de aluminossilicato	Instrumentos Sutter, Novato CA EUA	AF100-64-10	para fazer eletrodos
Lâminas de microscópio Superfrost	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	12-550-143	para estação de preparação de moscas
Fita dupla face permanente	Scotch St. Paul MN EUA	NA	para estação de preparação de moscas
Microscópio vertical	Olympus, Shinjuku, Tóquio, Japão	BX51	para equipamento de gravação
Massa de modelar Plastalina	Van Aken, North Charleston SC EUA	B0019QZMQQ	para a estação da preparação e para estabilizar a haste guardando
Unidade de filtro descartável estéril de fluxo rápido com membrana SFCA, 0,45 mm	Nalgene, Rochester, NY, EUA	#156-4045	para esterilizar a solução AHL
Ponteira de pipeta de 200 μL	VWR Radnor, PA EUA	Rolamento 53508-810	para fazer cartuchos de odor e preparação de moscas
Papel de filtro	Whatman, Maidstone Kent Reino Unido	740-E	para fazer cartuchos de odor
Dessecador a vácuo	Cole-Parmer, Vernon Hills IL EUA	VX-06514-30	para vaporizar solvente de etanol
ácido cis-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Odorizante Or47b
ácido trans-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Odorizante Or47b
etanol	Spectrum Chemical MFG. New Brunswick, NJ, EUA	E1028-500MLGL	para diluir o ácido palmitoleico
Micromanipulador de cartucho odorante	Siskiyou, Grants Pass OU EUA	MX130R	para posicionar o olfatômetro
Software Flow Vision	Alicat, Tuscon AZ EUA	FLOWVISIONSC	Software para controlar a vazão
Controlador de massa	Alicat, Tuscon AZ EUA	MC-2SLPM-D	para controlar a vazão do ar umidificado
Controlador de massa	Alicat, Tuscon AZ EUA	MC-500SCCM-D	para controlar a taxa de fluxo para estimulação de odor
Clampex	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale CA EUA	Ver. 10.4	Software de aquisição de dados
Tubo de entrega de ar	Ace Glass, Vineland, NJ, EUA	8802-936	para fornecer ar umidificado
Lente objetiva 50X	Olympus, Shinjuku, Tóquio, Japão	LMPLFL50X	equipamento de gravação
Clampfit 10	Dispositivos Moleculares, Sunnyvale CA EUA	Ver. 10.4	Software para análise de pico
Igor Pro 6	WaveMetrics, Lago Oswego OU EUA	Versão 6.37	Software para análise de dados
Monitor de áudio	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY EUA	NPIEXB-AUDIS-08B	Relata auditivamente picos individuais
Amplificador Extracelular	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY EUA	NPIEXT-02F	para aumentar a amplitude dos sinais elétricos
Controlador de válvula	Warner Instruments	VC-8	para controlar a abertura da válvula para estimulação de odor
Micromanipulador de eletrodo de gravação	Instrumentos Sutter, Novato CA EUA	MP-285	para posicionar o eletrodo de gravação
Amplificador de palco	ALA Scientific Instruments, Farmingdale NY EUA	EQ-16.0008	para aumentar a amplitude dos sinais elétricos
osciloscópio	Tektronix, Beaverton OU EUA	TDS2000C	Relatório visual de picos individuais