Estimulação da raiz nervosa auditiva e gravações de corrente pós-sináptica em uma fatia de cunha de cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Fischl, M. J., et al. Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar a conectividade do circuito neuronal in vivo. J. Vis. Exp.(2020)

Este vídeo demonstra um protocolo para estimular a raiz nervosa auditiva e registrar correntes pós-sinápticas em neurônios olivococleares mediais em fatias de cunha cerebral de camundongo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Configuração e gravação de eletrofisiologia

1. Coloque a fatia de cunha na câmara de gravação e prenda a fatia com uma harpa ou sistema estabilizador. Perfunda o tecido continuamente a uma taxa de 7-10 mL / min com ACSF quente (35 ° C) borbulhado com carbogênio.
2. Identifique neurônios MOC olivococleares mediais geneticamente marcados no núcleo ventral do corpo trapezoidal VNTB usando epifluorescência com filtros de emissão de 561 nm para gravações de patch-clamp. Vire a fatia se não houver células potencialmente corrigidas.
3. Usando a óptica DIC, concentre-se na raiz do nervo auditivo no lado grosso da fatia e use um micromanipulador para mover o eletrodo estimulante bipolar de tungstênio até a raiz do nervo auditivo e suavemente na superfície do tecido.
   nota: Eletrodos de sucção têm sido usados em experimentos de estimulação do nervo auditivo em outros laboratórios. Eletrodos de vidro Theta ou métodos de estimulação óptica podem ser empregados, se aplicável a outras preparações específicas.
4. Mova o campo de visão de volta para o VNTB para escolher um neurônio MOC para direcionar a eletrofisiologia do patch clamp.
5. Encher uma pipeta de registo com uma solução interna adequada para a experiência proposta.
6. Patch e registro do neurônio MOC na configuração de célula inteira. Compense a capacitância da membrana e a resistência em série, se necessário.
7. Ajustar a amplitude de estimulação elétrica da raiz nervosa auditiva para obter eventos pós-sinápticos consistentes no neurônio MOC.
   nota: Pode ser necessário mover o eletrodo de estimulação.
8. Executar protocolos de estimulação apropriados para observar correntes sinápticas evocadas em MOC (grampo de tensão).
   nota: A preparação da fatia em cunha pode ser usada com qualquer ferramenta típica de patch-clamp, como gravações de adesivos soltos, farmacologia, optogenética, imagens de cálcio, desenjaulamento de neurotransmissores, etc.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Confocal Vertical A1R	Instrumentos Nikon		Microscópio de eletrofisiologia e imagem, pode ser qualquer microscópio compatível com eletrofisiologia
Eletrodo Vidro borossilicato c/ Filamento OD 1,5mm, ID 1,1mm, 10 cm de comprimento	Instrumento Sutter	BF150-110-10	Vidro de pipeta de fixação de remendo
Enchimento de eletrodo MicroFil	WPI	CMF20G	Enchimento de pipeta de eletrodo de remendo
Aquecedor de solução em linha	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Aquecedor do sistema de perfusão de fatias
Sistemas Multi-Micromanipuladores	Instrumentos Sutter	MPC-200 com MP285	Micromanipuladores para colocação de patch clamp e eletrodo de estimulação
Extrator de pipetas horizontais P-1000 para micropipetas de vidro	Instrumentos Sutter	FG-P1000	Extrator de pipetador de braçadeira de remendo
Amplificador e software de fixação de remendo	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Próximo	Pode ser qualquer amplificador/software
Câmara de Gravação	Warner Instruments	RC26G	Corte o "banho" durante a gravação
Harpa de Câmara de Gravação	Warner Instruments	640253	Estabiliza o corte durante o registro de eletrofisiologia
Câmara de incubação de fatia	Construção personalizada		Câmara de retenção aquecida e oxigenada para fatias durante a recuperação após o corte
Unidade de isolamento de estímulo	A.M.P.I.	Iso-Flex	Unidade de isolamento de estímulos para eletrofisiologia
Seringa 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	14-820-11	Eletrofisiologia perfusão Manuseio de fluidos
Controlador de temperatura	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Controlador de temperatura do sistema de perfusão de fatias
Tubulação 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Eletrofisiologia perfusão Manuseio de fluidos
Microeletrodo bipolar concêntrico Tugsten	WPI	TM33CCINS	Eletrodo estimulante para eletrofisiologia