$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Registro de respostas sinápticas CA3-CA1
NOTA: A configuração eletrofisiológica usada para registro de potencial de campo é mostrada na Figura 1A. Uma gaiola de Faraday é fortemente recomendada se a interferência elétrica estiver além do controle após o aterramento adequado das configurações elétricas. Muitos tipos diferentes de câmaras submersas e de interface estão disponíveis comercialmente. No entanto, as câmaras de interface são preferidas, pois as fatias exibem respostas sinápticas mais robustas nelas.
- Posicionamento de eletrodos
- Ligue o aparelho elétrico (estimuladores e amplificadores) a ser usado. Monte e prenda os eletrodos de estimulação e gravação nos suportes de plexiglass dos micromanipuladores.
nota: Usamos eletrodos monopolares, revestidos com laca, de aço inoxidável de 5 MΩ de resistência para fins de estimulação e gravação.
- Antes de usar, insira esses eletrodos dentro dos capilares de vidro puxados e prenda com cola epóxi, expondo apenas uma pequena parte da ponta do eletrodo (Figura 1E). Isso dá força aos eletrodos finos e ajuda a prendê-los firmemente nos porta-eletrodos.
- Guiado ao microscópio, posicione o(s) eletrodo(s) estimulante(s) no estrato radiado da região CA1 para estimular as fibras colaterais de Schaffer e o eletrodo de registro na região dendrítica apical de CA1 para registrar as respostas de campo EPSP (fEPSP).
nota: Aproximar-se da superfície líquida acima da fatia com os eletrodos produz um som que ajuda a localizar a superfície da fatia rapidamente (desde que o amplificador esteja conectado a um alto-falante).
- Em experimentos de marcação e captura sináptica, de acordo com a necessidade do experimento, posicione dois ou três eletrodos estimulantes (S1, S2 ou S3) em ambos os lados do eletrodo de registro para estimular duas ou mais entradas independentes, mas sobrepostas. Posicione os eletrodos de estimulação e registro a cerca de 200 μm de distância.
- Se necessário, localize outro eletrodo de registro na camada piramidal do estrato para registrar o pico populacional (Figura 2A). Quando ambos os eletrodos tocarem a fatia, usando o software de aquisição, faça um teste de estimulação para garantir um sinal fEPSP adequado.
nota: Usamos pulsos bifásicos de corrente constante (duração do impulso 0,1 ms / meia onda) para estimulação de teste.
- Uma vez obtido um sinal fEPSP adequado, abaixe cuidadosamente os eletrodos com cerca de 200 μm de profundidade usando botões de movimento fino dos manipuladores. Aguarde 20 minutos para que as fatias se recuperem.
- Relação de entrada-saída
- Determine a relação de entrada-saída (estimulação aferente vs inclinação fEPSP) para cada entrada medindo o valor da inclinação em uma faixa de intensidades de corrente. Faça isso entre 20 μA a 100 μA. Em seguida, defina a intensidade de estimulação para cada entrada para obter 40% da inclinação máxima de fEPSP. Mantenha isso constante durante todo o experimento.
- Após 15-20 minutos, comece a gravar a linha de base. Monitore a inclinação do fEPSP de perto durante este período e redefina a intensidade do estímulo se a inclinação flutuar mais de 10% em relação ao valor definido e inicie uma nova linha de base. Registre pelo menos 30 min ou 1 hora de linha de base estável antes de prosseguir.
nota: Para o teste ou a estimulação basal, usamos quatro varreduras de pulsos bifásicos de corrente constante de 0,2 Hz (0,1 ms por polaridade) dados a cada 5 min. Uma inclinação média dessas quatro respostas é então considerada como uma repetição. Os sinais são filtrados e amplificados por um amplificador diferencial, digitalizados usando um conversor analógico-digital e monitorados online com software personalizado.
