Detecção de respostas fisiológicas de neurônios sensoriais em Drosophila

Resumo

Fonte: Shankar, S., et al. Medindo as respostas fisiológicas dos neurônios sensoriais da Drosophila aos feromônios lipídicos usando imagens de cálcio ao vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um método para detectar respostas de neurônios sensoriais em Drosophila usando ligação de ligante e imagem de fluorescência. Os ligantes se ligam aos receptores dos neurônios, causando o influxo de cálcio. O cálcio se liga aos complexos indicadores, levando à emissão de fluorescência, o que confirma a resposta neuronal ao ligante.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Atravesse a linha do driver Gal4 para UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster voa (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Permitir que a cruz cresça a 25 °C.
   nota: A geração de moscas com várias cópias dos transgenes Gal4 ou UAS-GCaMP pode ajudar a aumentar a intensidade do sinal fluorescente. Uma versão anterior do transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostrou intensidade de fluorescência muito fraca quando expressa sob o controle do driver Gr68a-Gal4.
   1. Coletar e separar por sexo as moscas adultas recém-fechadas e elevá-las a 25 °C.
      NOTA: O nível basal de fluorescência GCaMP5G é ideal em moscas com idade entre 14 e 28 dias. Isolar moscas por sexo exclui a possibilidade de interações sociais que podem influenciar as respostas neurais.
2. Anestesiar uma mosca sob um leve fluxo de CO₂.
3. Prenda a braguilha a uma lamínula de vidro colocando primeiro uma pequena gota de esmalte no centro de uma lamínula de 0,17 mm. Coloque delicadamente uma mosca de lado na gota do esmalte transparente e certifique-se de que a mosca cubra toda a gota.
4. Execute as etapas 1.5 e 1.6 em um estereomicroscópio de dissecação, usado com ampliação de 8X.
5. Use um pincel úmido para estender a pata dianteira da mosca. Prenda a perna dianteira na posição colocando duas tiras finas de fita adesiva sobre o primeiro e o quinto segmentos do tarso (Figura 1A). Isso exporá os segmentos tarsais T2-T4 para imagem (Figura 1B).
6. Para obter imagens dos neurônios na tromba, coloque uma tira fina de fita adesiva sobre o rostro da tromba para expor o labelo (Figura 1C, D).
7. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da mosca com uma caneta PAP (Peroxidase-antiperoxidase) para evitar que a solução escorra sobre a superfície da lamínula. Meça dentro de 30 minutos após a montagem.

2. Preparação da Solução de Estímulo

1. Ligantes lipofílicos diluídos (como CH₅0₃, usado neste estudo) em uma solução PBST (solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1% Triton X-100 (v / v); pH 7,4.
   1. Fazer uma solução-mãe de 1 mg/ml do ligante utilizando PBST. Preparar todas as diluições subsequentes da solução-mãe utilizando PBST.
      nota: Dependendo da solubilidade do ligante de interesse, diferentes solventes podem ser necessários para dissolvê-lo. A Tabela 1 descreve a solubilidade de CH₅0₃ em vários solventes. Ao contrário de outros solventes, o PBST não aumentou a fluorescência.

3. Estimulação de neurônios gustativos e aquisição de imagens

1. Usando um pipetador de 10 μl, coloque 10 μl de PBST nos segmentos do tarso.
   nota: Esta etapa umedece a perna e evita que os segmentos do tarso se desviem.
2. Use um sistema óptico que tenha uma câmera de velocidade e sensibilidade suficientes para obter um bom sinal de fluorescência em alta resolução de tempo.
   nota: Para este estudo, usamos um microscópio confocal de disco giratório e uma câmera sCMOS (ver Lista de Materiais).
3. Escolha o segmento tarsal específico e os neurônios a serem visualizados. Adquira três pilhas Z confocais de pré-estimulação.
   1. O ideal é usar configurações de aquisição rápidas o suficiente para permitir a resolução máxima de tempo enquanto ainda captura todo o volume da célula. Exemplos de configurações de aquisição são: exposição de 200 ms, binning de seções ópticas de 2 x 2 e 6 x 0,5 μm2, capturadas a cada 2 seg.
      NOTA: As pernas imobilizadas foram fotografadas com sucesso por até 10 minutos, em intervalos de 30 segundos, sem branqueamento discernível do sinal GCaMP. Para tempos de gravação mais longos, certifique-se de que as pernas estejam firmemente presas na lamínula.
   2. Otimize a potência do laser para obter a mais alta relação sinal-ruído possível com o mínimo de fotobranqueamento durante todo o regime de imagem. Para os experimentos descritos aqui, use um laser de diodo de 491 nm (100 mW) a 30% de transmissão para obter imagens dos neurônios gustativos Gr68a e ppk23 nas pernas e na tromba. Use binning 2 x 2 para permitir tempos de exposição mais curtos e, ao mesmo tempo, obter resolução espacial suficiente.
      nota: As configurações de potência do laser foram otimizadas para detectar alterações fluorescentes que variam de um aumento de 1,2 a 4,5 vezes.
4. Pipetar 10 μl da solução de estímulo para os segmentos tarsais. Adicione mais 10 μl de PBST para experimentos de controle. Adquira imediatamente 117 imagens pós-estimulação.
   nota: O número de imagens pós-estimulação adquiridas é baseado no tempo que levou para atingir a mudança máxima na fluorescência (aproximadamente 2 min).
   1. ETAPA CRÍTICA: Ao pipetar a solução na preparação, não toque na braguilha com a ponta da pipeta, pois isso fará com que a perna dianteira saia da posição.
      nota: Como alternativa, use um micromanipulador para posicionar com precisão um capilar de vidro contendo estímulo próximo ao segmento do tarso a ser fotografado. Forneça volumes controlados de estímulo usando um dispensador de microinjeção intracelular de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Figura 1: Montando uma mosca viva para imagens dos neurônios da perna dianteira ou da probóscide. (A) Montando a perna dianteira: uma imagem 3,2X de uma mosca macho viva, mostrando as patas dianteiras presas à lamínula com fita adesiva. (B) Uma imagem 40X da mosca mostra cada um dos segmentos do tarso (T1-5) e a colocação da fita acima do primeiro segmento do tarso e no quinto segmento do tarso. (C) ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gr68a-gal4			Presente de H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, EUA) e J. Carlson (Yale University, CT, EUA)
ppk23-gal4			Presente de K. Scott (Univ. da Califórnia, Berkeley, CA, EUA)
UAS-GCaMP5		Nº 42037	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington
lamínula de 0,17 mm (lamínula Gold-Seal)	Serviços de Microscopia Eletrônica	Nº 63790-10
Esmalte, "Hard as Nails Clear"	Sally Hansen
Caneta PAP	Sigma-Aldrich	Z377821
Pincel			Pincel de ponta fina
fita	Marca escocesa
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	Rolamento 13021
Etanol, grau laboratorial	Merck	10094
Hexano, grau HPLC	Sigma-Aldrich	H303SK-4
Dmso	Sigma-Aldrich	472301
PBST			Receita descrita na seção de protocolo
CH503			Síntese descrita em Mori et al., 2010
Câmera sCMOS (ORCA Flash4.0)	Hamamatsu	C11578-22U
Microscópio (Ti-Eclipse)	Nikon	Ni-E
Cabeça de varredura de disco giratório	Yokogawa	CSU-X1-A1