Detecção de respostas fisiológicas de neurônios sensoriais em Drosophila

1. Preparação da amostra

1. Atravesse a linha do driver Gal4 para UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster voa (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Permitir que a cruz cresça a 25 °C.
   nota: A geração de moscas com várias cópias dos transgenes Gal4 ou UAS-GCaMP pode ajudar a aumentar a intensidade do sinal fluorescente. Uma versão anterior do transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostrou intensidade de fluorescência muito fraca quando expressa sob o controle do driver Gr68a-Gal4.
   1. Coletar e separar por sexo as moscas adultas recém-fechadas e elevá-las a 25 °C.
      NOTA: O nível basal de fluorescência GCaMP5G é ideal em moscas com idade entre 14 e 28 dias. Isolar moscas por sexo exclui a possibilidade de interações sociais que podem influenciar as respostas neurais.
2. Anestesiar uma mosca sob um leve fluxo de CO₂.
3. Prenda a braguilha a uma lamínula de vidro colocando primeiro uma pequena gota de esmalte no centro de uma lamínula de 0,17 mm. Coloque delicadamente uma mosca de lado na gota do esmalte transparente e certifique-se de que a mosca cubra toda a gota.
4. Execute as etapas 1.5 e 1.6 em um estereomicroscópio de dissecação, usado com ampliação de 8X.
5. Use um pincel úmido para estender a pata dianteira da mosca. Prenda a perna dianteira na posição colocando duas tiras finas de fita adesiva sobre o primeiro e o quinto segmentos do tarso (Figura 1A). Isso exporá os segmentos tarsais T2-T4 para imagem (Figura 1B).
6. Para obter imagens dos neurônios na tromba, coloque uma tira fina de fita adesiva sobre o rostro da tromba para expor o labelo (Figura 1C, D).
7. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da mosca com uma caneta PAP (Peroxidase-antiperoxidase) para evitar que a solução escorra sobre a superfície da lamínula. Meça dentro de 30 minutos após a montagem.

2. Preparação da Solução de Estímulo

1. Ligantes lipofílicos diluídos (como CH₅0₃, usado neste estudo) em uma solução PBST (solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1% Triton X-100 (v / v); pH 7,4.
   1. Fazer uma solução-mãe de 1 mg/ml do ligante utilizando PBST. Preparar todas as diluições subsequentes da solução-mãe utilizando PBST.
      nota: Dependendo da solubilidade do ligante de interesse, diferentes solventes podem ser necessários para dissolvê-lo. A Tabela 1 descreve a solubilidade de CH₅0₃ em vários solventes. Ao contrário de outros solventes, o PBST não aumentou a fluorescência.

3. Estimulação de neurônios gustativos e aquisição de imagens

1. Usando um pipetador de 10 μl, coloque 10 μl de PBST nos segmentos do tarso.
   nota: Esta etapa umedece a perna e evita que os segmentos do tarso se desviem.
2. Use um sistema óptico que tenha uma câmera de velocidade e sensibilidade suficientes para obter um bom sinal de fluorescência em alta resolução de tempo.
   nota: Para este estudo, usamos um microscópio confocal de disco giratório e uma câmera sCMOS (ver Lista de Materiais).
3. Escolha o segmento tarsal específico e os neurônios a serem visualizados. Adquira três pilhas Z confocais de pré-estimulação.
   1. O ideal é usar configurações de aquisição rápidas o suficiente para permitir a resolução máxima de tempo enquanto ainda captura todo o volume da célula. Exemplos de configurações de aquisição são: exposição de 200 ms, binning de seções ópticas de 2 x 2 e 6 x 0,5 μm2, capturadas a cada 2 seg.
      NOTA: As pernas imobilizadas foram fotografadas com sucesso por até 10 minutos, em intervalos de 30 segundos, sem branqueamento discernível do sinal GCaMP. Para tempos de gravação mais longos, certifique-se de que as pernas estejam firmemente presas na lamínula.
   2. Otimize a potência do laser para obter a mais alta relação sinal-ruído possível com o mínimo de fotobranqueamento durante todo o regime de imagem. Para os experimentos descritos aqui, use um laser de diodo de 491 nm (100 mW) a 30% de transmissão para obter imagens dos neurônios gustativos Gr68a e ppk23 nas pernas e na tromba. Use binning 2 x 2 para permitir tempos de exposição mais curtos e, ao mesmo tempo, obter resolução espacial suficiente.
      nota: As configurações de potência do laser foram otimizadas para detectar alterações fluorescentes que variam de um aumento de 1,2 a 4,5 vezes.
4. Pipetar 10 μl da solução de estímulo para os segmentos tarsais. Adicione mais 10 μl de PBST para experimentos de controle. Adquira imediatamente 117 imagens pós-estimulação.
   nota: O número de imagens pós-estimulação adquiridas é baseado no tempo que levou para atingir a mudança máxima na fluorescência (aproximadamente 2 min).
   1. ETAPA CRÍTICA: Ao pipetar a solução na preparação, não toque na braguilha com a ponta da pipeta, pois isso fará com que a perna dianteira saia da posição.
      nota: Como alternativa, use um micromanipulador para posicionar com precisão um capilar de vidro contendo estímulo próximo ao segmento do tarso a ser fotografado. Forneça volumes controlados de estímulo usando um dispensador de microinjeção intracelular de acordo com as instruções do fabricante.

Figura 1: Montando uma mosca viva para imagens dos neurônios da perna dianteira ou da probóscide. (A) Montando a perna dianteira: uma imagem 3,2X de uma mosca macho viva, mostrando as patas dianteiras presas à lamínula com fita adesiva. (B) Uma imagem 40X da mosca mostra cada um dos segmentos do tarso (T1-5) e a colocação da fita acima do primeiro segmento do tarso e no quinto segmento do tarso. (C) Montagem da tromba: um pedaço de fita adesiva é colocado sobre o rostro para expor a ponta da tromba. (D) A ponta da pipeta para adição de estímulo é mantida ligeiramente acima da mosca e não faz contato direto com a preparação.

Tabela 1: Solubilidade de CH503 em vários solventes. DMSO: Dimetilsulfóxido. As soluções de etanol, hexano e DMSO foram diluídas com dH2O (v/v). A solubilidade do CH503 em DMSO a 0,2% foi limitada apenas a 250 ng/ml. O aumento de ΔF/F com solvente isolado foi equivalente ao observado após a estimulação com feromônio.