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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Cirurgia
NOTA: Os detalhes exatos da cirurgia para estimulação em circuito fechado dependem do tipo de sondas de gravação usadas e das áreas cerebrais visadas. Na maioria dos casos, no entanto, uma cirurgia típica consistirá nas seguintes etapas.
- Traga uma gaiola com um rato para a sala de cirurgia para ser implantada com uma sonda de silicone ou conjunto de eletrodos para registrar a atividade neuronal.
- Anestesie o roedor com isoflurano a 2-2,5% e fixe a cabeça em uma estrutura estereotáxica. Certifique-se de que o animal esteja inconsciente durante a cirurgia, observando qualquer reação motora a estímulos táteis leves.
- Aplique uma pomada para os olhos para minimizar o ressecamento durante a cirurgia.
- Depile a área cirúrgica e desinfete a pele com solução de clorexidina a 2% e álcool isopropílico a 70%.
- Injete lidocaína (5 mg/kg) sob o couro cabeludo sobre a área do cérebro onde os eletrodos serão implantados.
- Faça uma incisão no couro cabeludo sobre a área do futuro implante e use um bisturi e um cotonete para limpar o periósteo do crânio exposto.
- Faça 4-8 furos no crânio para implantação de parafusos de ancoragem (~0,5 mm) como suporte estrutural para o implante. Prenda os parafusos ao crânio inserindo-os nos orifícios e certifique-se de que estejam firmemente presos no lugar.
- Perfure a craniotomia nas coordenadas especificadas e insira o implante de microdrive/sonda.
nota: O protocolo descrito para estimulação em circuito fechado funcionará para qualquer região do cérebro na qual os eletrodos estejam inseridos.
- Fixe o microdrive/sonda e qualquer conector de interface elétrica necessário ao crânio usando acrílico dental. A quantidade de acrílico dentário deve ser suficiente para fixar o implante com firmeza, mas não deve entrar em contato com o tecido mole circundante.
- Após a cirurgia, monitore de perto o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Nos três dias subsequentes, administre por via subcutânea um analgésico (por exemplo,., Metacam, 1 mg/kg) e um antibiótico para prevenir a infecção (por exemplo,., enrofloxacina, 10 mg/kg).
nota: Os animais são normalmente deixados para se recuperar da cirurgia por uma semana antes de qualquer teste ou registro.
2. Instalação de software
NOTA: Isso foi testado no Windows 10, versão de 64 bits.
- Instale o software de aquisição e processamento de dados.
- Instale o sistema de aquisição de dados Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), que inclui bibliotecas para interagir com o Cheetah Acquisition System.
- Instale o SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) ou qualquer outro software que use o KlustaKwik27 para classificação de picos. O software de detecção online usa as definições de cluster do mecanismo KlustaKwik. Este software pode ser executado no mesmo computador ou em computadores separados na mesma rede.
- Instale o NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), que também pode ser baixado do https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
- Instale o Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; o código foi testado no Matlab versão R2018a). Certifique-se de que o Matlab esteja ativado no firewall do Windows. Normalmente, um pop-up aparecerá durante a primeira conexão.
- Faça login em uma conta Matlab. Escolha a licença. Escolha a versão. Escolha o sistema operacional.
- Baixe a seguinte biblioteca para acionamento de eventos online do https://github.com/leomol/cheetah-interface e extraia arquivos para a pasta 'Documentos/Matlab' do computador. Uma cópia do código é fornecida nos Materiais Suplementares que o acompanham.
3. Aquisição inicial de dados
- Inicie a aquisição de dados usando o software Cheetah.
- Registre alguns minutos de dados de pico para preencher as formas de onda do modelo.
- Pare a aquisição de dados e execute a classificação de pico nos dados registrados.
- Abra o SpikeSort3D, clique em Arquivo | Cardápio | Carregue o arquivo de pico e selecione um arquivo de pico da pasta com os dados gravados.
- Clique em Menu de Cluster, depois em Agrupar Automaticamente usando o KlustaKwik, deixando as configurações padrão e clique em Executar.
4. Experimento de malha fechada
- Retome a aquisição de dados no Cheetah.
- Abra o Matlab.
- Abra o ClosedLoop.m e clique em Executar. Como alternativa, na janela de comando do Matlab, execute ClosedLoop(). Certifique-se de que ClosedLoop.m esteja no caminho Matlab. Se o usuário quiser empregar uma função personalizada para chamar cada gatilho, execute ClosedLoop('-callback', customFunction), em que customFunction é um identificador para essa função.
- Carregue as informações de pico definidas na gravação inicial clicando em Carregar, navegando na pasta de gravação e selecionando um dos arquivos de dados de pico (.ntt, .nse).
- Selecione um ou vários neurônios que acionarão a estimulação clicando na caixa de seleção abaixo das formas de onda plotadas.
- Defina o número mínimo de neurônios que acionarão a estimulação digitando um número inteiro na caixa de texto "correspondências mínimas". Em seguida, defina a janela de tempo na qual os picos correspondentes a diferentes formas de onda são considerados coativos digitando um número na caixa de texto "janela".
- Clique em Enviar para iniciar. Isso iniciará o acionamento online de eventos (tons como padrão) com base na atividade de pico dos neurônios selecionados.