Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

Resumo

Fonte: Kinnavane, L., et al. Interrogação Optogenética Ex Vivo da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial ao Córtex Entorrinal Lateral. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o procedimento para estudar a eficiência sináptica no córtex entorrinal lateral (LEC) estimulando optogeneticamente os axônios do córtex pré-frontal medial (mPFC) e registrando as respostas dos neurônios piramidais no LEC. Este método combina gravações de patch-clamp com ativação sináptica por estimulação de luz para estudar a plasticidade sináptica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Eletrofisiologia e estimulação optogenética

1. Identificação da célula-alvo.
   1. Colocar a fatia numa câmara de registo submersa a 34 °C perfundida com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) a uma velocidade de 2 ml/min por uma bomba peristáltica. Imobilize a fatia usando uma âncora de fatia.
   2. Sob a objetiva de baixa ampliação (4x) de um microscópio de campo amplo usando iluminação infravermelha oblíqua, navegue até a camada 5 do córtex entorrinal lateral (LEC). Meça a distância da superfície pial até a camada necessária.
      nota: A iluminação infravermelha oblíqua foi obtida posicionando um LED infravermelho próximo aproximadamente 3 mm abaixo da lamínula da câmara de registro em um ângulo de ~ 55 ° em relação ao plano da lamínula (Figura 1B). O contraste de interferência diferencial é uma técnica de imagem alternativa e comumente usada para eletrofisiologia de corte.
   3. Mude para uma objetiva de imersão em água de alta ampliação (40x) e identifique os neurônios piramidais. Marque a posição da célula no monitor do computador com fita.
      nota: Os neurônios piramidais têm uma morfologia aproximadamente triangular com dendritos apicais proeminentes projetando-se em direção à superfície pial da fatia (Figura 2A). A saúde celular pode ser avaliada pela ausência de um núcleo condensado e visível e pela inspeção da membrana plasmática, que deve parecer lisa. É improvável que a marcação fluorescente clara dos axônios pela proteína de fusão opsina-fluoróforo seja visível ao usar um microscópio de fluorescência de campo amplo. Para visualizar projeções axonais, realize imuno-histoquímica post-hoc usando um anticorpo primário contra o fluoróforo da opsina e amplifique com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo do mesmo comprimento de onda ou semelhante.
2. Formação de patch clamp de célula inteira.​
   1. Fabrique uma micropipeta de vidro borossilicato usando um extrator de pipeta e encha-a com solução de registro intracelular filtrada (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico), 10 mM KCl (cloreto de potássio), 2 mM NaCl (cloreto de sódio), 2 mM MgATP (trifosfato de adenosina de magnésio), 1 mM MgCl (cloreto de magnésio), 0,3 mM NaGTP (trifosfato de guanosina sódica), 0,2 mM EGTA (ácido etilenoglicol tetracético), e 0,25% de biocitina produzida em UPW (água ultrapura), pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque a micropipeta cheia no suporte do eletrodo no patch-clamp cabeça do amplificadorstage , garantindo que o fio do eletrodo esteja em contato com a solução intracelular.
   2. Aplique pressão positiva por via oral soprando com força em um bocal (como uma seringa de 1 mL com o êmbolo removido) conectado por tubulação à porta lateral do porta-eletrodo e mantenha a pressão fechando uma válvula de três vias em linha. Levante a objetiva do microscópio de forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que possa ser visto no microscópio.
   3. Abra a janela Seal Test no WinLTP16 (ou outro software/osciloscópio de aquisição) e, com o amplificador no modo de grampo de tensão, aplique um pulso quadrado de 5 mV para determinar se a resistência da pipeta é de 3-6 MΩ.
   4. Aproxime-se e toque a célula identificada com a ponta da pipeta; isso deve resultar em um recuo na membrana celular (Figura 2A; painel direito) e um pequeno aumento na resistência da pipeta (0,1 MΩ).
   5. Libere a pressão positiva e aplique pressão negativa aplicando sucção moderada no bocal; isso deve resultar em um grande aumento na resistência da pipeta (>1000 MΩ). A pressão agora pode ser deixada neutra. Aplique pressão negativa em uma rampa que aumente gradualmente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de toda a célula.
3. Registre eventos sinápticos evocados optogeneticamente.
   1. Insira a configuração do grampo de corrente.
      NOTA: Na maioria dos casos, a transmissão sináptica de longo alcance é glutamatérgica, portanto, o registro em potenciais de membrana próximos ao potencial de reversão de cloreto isolará melhor a transmissão mediada pelo receptor AMPA (AMPAR) e minimizará a medição de qualquer inibição feed-forward (FFI) evocada. A reversão do cloreto depende da composição da solução de registro intracelular e do aCSF e pode ser calculada usando a equação de Goldman-Hodgkin-Katz; para as soluções acima, isso foi de -61,3 mV. Os neurônios piramidais LEC da camada 5 tinham um potencial médio de membrana em repouso de -62 mV e, quando necessário, eram mantidos nesse potencial por injeção de corrente constante. Alternativamente, as células podem ser fixadas em voltagem para o potencial desejado. Para registrar projeções inibitórias de longo alcance16 ou para registrar FFI, clamp de tensão no potencial de reversão catiônica para isolar a condutância do cloreto GABAérgico. Quando os neurônios de fixação de voltagem em potenciais de membrana acima do limite do potencial de ação, uma solução intracelular à base de césio contendo bloqueadores dos canais de sódio dependentes de voltagem é usada para melhorar o clampeamento de voltagem e prevenir o início dos potenciais de ação (130 mM CsMeSO4 (metanossulfonato de césio), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloreto, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% de biocitina produzida em UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Usando o software de aquisição de dados, envie sinais lógicos de transistor-transistor (TTL) para um driver de LED (diodo emissor de luz) para ativar um LED de 470 nm montado. O LED montado é direcionado para o caminho da luz do microscópio usando cubos de filtro e óptica apropriada (Figura 1B) para aplicar pulsos de luz ao corte por meio da objetiva de 40x para evocar potenciais pós-sinápticos excitatórios optogenéticos (oEPSPs).
      nota: Os pulsos de luz podem ser aplicados perisomaticamente/sobre os dendritos, o que resultará na ativação de opsinas nos axônios e no botão pré-sináptico, ou o investigador pode mover a objetiva para os axônios para longe da célula registrada para evitar a estimulação excessiva. A amplitude máxima de oEPSP depende da força da projeção sináptica, da eficácia das injeções virais e da opsina usada. oEPSPs podem ser titulados para a amplitude desejada variando a intensidade e/ou duração da luz18; variar a duração dos pulsos de luz (duração típica entre 0,2-5 ms na potência máxima do LED, o que resulta em densidade de luz de 4,4 mW / mm19) fornece amplitudes oEPSP mais consistentes do que alterar a potência de saída do LED.
   3. Investigar as propriedades de liberação pré-sináptica (mudança na voltagem) fornecendo trens de múltiplos pulsos de luz com diferentes intervalos entre estímulos (Figura 2E); deve-se tomar cuidado ao interpretar a transmissão evocada optogeneticamente.
   4. Investigue a plasticidade a longo prazo evocando repetidamente oEPSPs19 ou aplicação de ligantes. Monitore a amplitude do oEPSP por 5 a 10 minutos para garantir a estabilidade antes da indução da plasticidade e, em seguida, monitore até que uma amplitude estável seja alcançada (normalmente 30 a 40 minutos).
      nota: A maioria das opsinas atuais não é capaz de evocar de forma confiável múltiplos potenciais de ação em altas frequências, por exemplo, 100 estímulos entregues a 100 Hz, como é normalmente usado para induzir LTP.
   5. Para confirmar que os oEPSPs são monossinápticos, realize a ativação sobre o botão da via transduzida posicionando a objetiva sobre a árvore dendrítica e estimulando na presença de 0,5 μM de tetrodotoxina e 100 μM de aminopiridina. A aplicação de tetrodotoxina abolirá a transmissão se as respostas forem dependentes do potencial de ação, e a inclusão subsequente de aminopiridina restaurará parcialmente a transmissão se os oEPSPs forem gerados monossinapticamente 19 , 20 .
   6. Para permitir que a biocitina preencha o neurônio, aguarde pelo menos 15 minutos após entrar na configuração de toda a célula. No grampo de tensão, monitore a capacitância da membrana e a resistência de entrada.
   7. Retire lentamente a pipeta ao longo do ângulo de aproximação para longe do soma da célula, observando o lento desaparecimento dos transientes de capacitância e da corrente da membrana, indicando o novo selamento da membrana celular e a formação de um remendo de fora para fora na ponta da pipeta. Observe a orientação da fatia e a localização da(s) célula(s) dentro da fatia. Coloque a fatia em PFA (paraformaldeído) em uma placa de 24 poços, incube durante a noite a 4 °C e depois transfira para 0,1 M PB.
      nota: As fatias podem ser armazenadas por até uma semana. Se for necessário um armazenamento mais longo, troque o PB (tampão fosfato) regularmente ou use PB contendo azida sódica (0,02% -0,2% de azida sódica).

Resultados

Figura 1: Câmara de coleta de fatias e configuração óptica para gravações visualizadas de células inteiras, excitação optogenética e identificação de neurônios tdTomate-positivos. (A) A câmara de coleta de fatias14 é feita sob medida a partir de um rack de tubos de microcentrífuga colado em uma folha de malha de náilon e colocado em um béquer no qual é submerso em aCSF (B

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Válvula Luer de 3 vias	Cole-Parmer	WZ-30600-02
Objetiva 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW
4-aminopiridina	Olá Biografia	HB1073
4x objetivo	Olimpo	PLN4X/0.1
Lente acromática	Óptica Edmund	Rolamento 49363	Focaliza o espectro visual e infravermelho próximo
Microcentrífuga de bancada	Benchmark Científico	C1005*
Biocitina	Sigma-Aldrich	B4261
Capilar de vidro borosilicado.	Warner Instruments	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Câmera - Qimaging Retiga Electro	Fotometria	01-ELECTRO-M-14-C
Carbacol	Tocris	2810
Esfoliação cirúrgica com clorexidina	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	Rolamento 22445	Aparador de lâmina destacável AGC Super 2-Speed
Lente condensadora de colimação	ThorLabs	ACL2520-A
Lamínulas	Fisher Científica Ltda	10011913
Criostato	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Cola de cianoacrilato	Eletrônica Rápida Ltda	Rolamento 84-4557
Dispositivo de aquisição de dados	Instrumentos nacionais	USB-6341 BNC
D-glicose	Sigma-Aldrich	G8270
Espelho dicróico passa-longa de 500 nm	Óptica Edmund	Nº 69899
Espelho dicróico de 600 nm de passagem longa	Óptica Edmund	Nº 69901
Cubo de espelho dicróico	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Moinho	324626
Suporte de eletrodo com porta lateral	HEKA	Rolamento 895150
Filtro de emissão	Chroma	59022m
Filtro de excitação	Chroma	ET570/20x
Gel para os olhos	Dechra	Lubrificante
Pincel fino	Suprimentos de Laboratório Científico	BRU2052
guilhotina	Instrumentos de precisão mundiais	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Solução de peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich	H1009	30% (p/p)
Isoflurano	Henry Schein	Rolamento 988-3245
Isopentano	Sigma-Aldrich	M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 3911
K-gluconato	Sigma-Aldrich	G4500
Cubo filtrante de fluorescência cinemática	ThorLabs	DFM1T1
Driver de LED	ThorLabs	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	Resposta A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Extrator de microeletrodo	Instrumentos Sutter	Pág. 87
Seringa de microinjeção	Hamilton	Rolamento 7634-01/00
Agulha de seringa para microinjeção	Hamilton	7803-05	Especificação personalizada: bitola 33, comprimento 15mm, estilo de ponta 4 - 12°
Bomba de seringa para microinjeção	Instrumentos de precisão mundiais	UMP3T-1
LED azul montado	ThorLabs	M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
LED NIR	OSRAM	SFH4550	Usada para imagens IR refratadas de fatia, a óptica de contraste de interferência diferencial (DIC) é outro método comumente usado
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Pág. 6148
Amplificador de patch clamp	Dispositivos Moleculares	700A
Bomba peristáltica	Instrumentos de precisão mundiais	Miniestrela
Lâminas de microscópio revestidas com poli-L-lisina	Fisher Científica Ltda	Telefone: 23-769-310
Câmara de gravação	Warner Instruments	RC-26G
Fatiar âncora	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Suporte estereotáxico para micro broca	Aparelho de Harvard	75-1874
sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
Microscópio cirúrgico	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Filtro de seringa para solução de registro intracelular	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Microscópio de fluorescência vertical	Leica	DM6 B
solução
aCSF
Solução de corte de sacarose
PFA