Carga e descarga de corante FM mediada por microeletrodo em células nervosas de larvas de Drosophila

Resumo

Fonte: Kopke, D. L., et al., Ciclo de corante FM na sinapse: comparando alta despolarização de potássio, estimulação elétrica e de canalizrodopsina. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, as fibras nervosas das larvas de Drosophila são imersas em corante FM, que se liga aos lipídios da membrana celular. O microeletrodo de sucção e os pulsos elétricos estimulam o processo de endocitose, incorporando o corante FM em vesículas endocíticas recém-formadas. Este método, que visualiza estágios pré-sinápticos de neurotransmissão, é útil para estudar a função sináptica e a liberação de neurotransmissores.

Protocolo

1. Dissecção de cola larval

1. Misture bem 10 partes da base de elastômero de silicone com 1 parte do agente de cura de elastômero de silicone do kit de elastômero.
2. Cobrir lamínulas de vidro de 22 x 22 mm com elastómero e catalisar numa placa quente a 75 °C durante várias horas (até deixar de ficar pegajosa ao toque).
3. Coloque uma única lamínula de vidro revestida com elastômero na câmara de dissecação de vidro plexi feita sob medida para a dissecção larval.
4. Prepare as pipetas de cola a partir de capilar de vidro borossilicato usando um extrator de microeletrodo padrão para obter o cone e o tamanho da ponta desejados.
5. Quebre suavemente a ponta da micropipeta e, na outra extremidade, prenda 2 pés de tubo de plástico flexível (1/32" de diâmetro interno, ID; 3/32" de diâmetro externo, OD; parede de 1/32"; com encaixe de boca (ponta de pipeta P2).
6. Em preparação para a dissecção larval, encha um pequeno recipiente (tampa do tubo Eppendorf de 0,6 mL) com um pequeno volume (~ 20 μL) de cola.
7. Encha a câmara com solução salina (em mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarose e 5 ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) pH 7.2.
8. Adicione o anticorpo anti-peroxidase de rabanete (HRP) conjugado ao Alexa Fluor 647 (anti-HRP: 647; diluir 1:10 de um estoque de 1 mg / mL) para marcar o terminal pré-sináptico da JNM durante a dissecção 21 , 22 .
9. Usando um pincel fino (tamanho 2), remova um terceiro ínstar errante do frasco de alimento e coloque-o sobre a lamínula revestida de elastômero.
10. Encha a ponta da micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola usando pressão de ar negativa gerada pela boca com acessório (etapa 1.5).
11. Posicione o lado dorsal da larva para cima com uma pinça e cole a cabeça na lamínula revestida de elastômero com uma pequena gota de cola usando pressão de ar positiva por via oral.
12. Repita este procedimento com a extremidade posterior da larva, garantindo que o animal seja esticado entre os dois acessórios de cola.
13. Usando uma tesoura (lâminas de 3 mm), faça um corte horizontal (~ 1 mm) na parte posterior e um corte vertical ao longo da linha média dorsal.
14. Usando uma pinça fina (# 5), remova suavemente a traqueia dorsal, o intestino, o corpo gorduroso e outros órgãos internos que cobrem a musculatura.
15. Repita o procedimento de colagem para as quatro abas da parede do corpo; estique suavemente a parede do corpo horizontal e verticalmente.
16. Levante o cordão nervoso ventral (VNC) usando uma pinça, corte cuidadosamente os nervos motores com a tesoura e, em seguida, remova completamente o VNC.
17. Para interromper o ciclo de SV, substitua a solução salina de dissecção por solução salina livre de Ca²⁺ (a mesma solução salina de dissecção acima sem o CaCl₂).

2. Estimulação Elétrica FM Dye Loading

1. Prepare uma pipeta de sucção usando o extrator de microeletrodos para obter o cone e o tamanho da ponta necessários.
2. Polir a ponta do microeletrodo com uma microforja até que um único nervo motor possa ser sugado com um ajuste apertado.
3. Deslize a pipeta de sucção no porta-eletrodo em um micromanipulador e conecte-a ao tubo de plástico longo e flexível e a uma seringa.
4. Defina os parâmetros do estimulador (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min ou 1 min.
5. Substitua a solução salina livre de Ca²⁺ na preparação larval pela solução salina FM1-43 acima (4 μM; 1 mM CaCl₂) na plataforma de eletrofisiologia.
6. Coloque a preparação no estágio do microscópio e levante o estágio até que a larva e a pipeta de sucção estejam focadas (objetiva de imersão em água 40X).
7. Sugue uma alça de nervo motor cortado inervando o hemissegmento selecionado com pressão de ar negativa gerada pela seringa no eletrodo de sucção.
8. Teste a função do eletrodo de sucção com uma pequena explosão de estimulação enquanto monitora visualmente a contração muscular no hemissegmento selecionado.
9. Estimule o nervo motor usando parâmetros selecionados (etapa 2.4) para conduzir a endocitose SV e a captação do corante FM1-43.
10. Lave rapidamente com solução salina livre de Ca²⁺ (5x por 1 min) para remover completamente a solução de corante FM1-43.
11. Mantenha a preparação larval em solução salina fresca livre de Ca²⁺ para imagem imediata usando o protocolo de imagem confocal de cima.
12. Anote cuidadosamente a imagem NMJ (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso ao mesmo NMJ após a descarga do corante FM.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de elastômero de silicone SylGard 184	Fisher Científico	NC9644388	Para colocar a tampa de vidro para dissecações
Vidro de cobertura do microscópio 22x22-1	Marca de pescador	12-542-B	Para colocar o SylGard para dissecações
Placa Quente Superior de Alumínio Tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Para curar o SylGard
Câmara de dissecção de vidro plexi	N/A	N/A	artesanal
Capilares de vidro borossilicato	WPI	1B100F-4	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Extrator de micropipeta baseado em laser	Instrumento Sutter	P-2000	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Tubulação de laboratório Tygon E-3603	Fornecimento de componentes Co.	TET-031A	Para boca e pipeta de sucção
Ponteira de pipeta P2	EUA Científico	1111-3700	Para pipeta bucal
Tampa do tubo Eppendorf de 0,6 mL	Fisher Científico	05-408-120	Usado para colocar cola para dissecação
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Cola usada para dissecações
Cloreto de potássio	Fisher Científico	Pág. 217	Forsalina
cloreto de sódio	Millipore Sigma	S5886	Para solução salina
Cloreto de magnésio	Fisher Científico	M35-500	Para solução salina
Cloreto de cálcio di-hidratado	Millipore Sigma	C7902	Para solução salina
sacarose	Fisher Científico	S5-3	Para solução salina
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solução salina
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para rotular membranas neuronais
pincel	Winsor & Newton	94376864793	Para manipular as larvas
Pinças Dumont Dumostar #5	WPI	500233	Usado durante a dissecção
Microtesoura McPherson-Vannas de 7 cm (lâminas de 3 mm)	WPI	Rolamento 14177	Usado durante a dissecção
FM1-43	Fisher Científico	T35356	Corante de estiril fluorescente
Temporizador digital	VWR	Nº 62344-641	Para cronometrar a carga/descarga de corante FM
Micro-Forja	WPI	MF200	Para disparar micropipetas de vidro polido
Ponta deslizante da seringa de 20mL	Bd	301625	Para sugar o axônio para estimulação elétrica.
Micro Manipulador (base magnética)	Narishige	MMN-9	Para controlar o eletrodo de sucção para estimulação elétrica
estimulador	grama	S48	Para controlar o LED e a estimulação elétrica
Microscópio Zeiss Axioskop	Zeiss		Usado durante a estimulação elétrica.
Objetiva de imersão em água Achroplan 40X	Zeiss		Usado durante estimulação elétrica e imagens confocais
Microscópio Zeiss Stemi com porta de câmera	Zeiss	2000-C	Usado durante a estimulação da channelrhodopsin
Driver de LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Para controlar o LED
Fonte de alimentação LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar o LED
Medidor de energia e potência óptica	ThorLabs	PM100D	Para medir a intensidade do LED