Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Resumo

Fonte: Kopke, D. L., et al., FM Ciclo de corante na sinapse: comparando alta despolarização de potássio, estimulação elétrica e de canalizrodopsina. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o que é demonstrado pela fluorescência reduzida.

Protocolo

1. Dissecção de cola larval

1. Misture bem 10 partes da base de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura de elastômero de silicone do kit de elastômero (Tabela de Materiais).
2. Cobrir lamínulas de vidro de 22 x 22 mm com elastómero e catalisar numa placa quente a 75 °C durante várias horas (até deixar de ficar pegajosa ao toque).
3. Coloque uma única lamínula de vidro revestida com elastômero na câmara de dissecação de plexiglass feita sob medida (Figura 1, parte inferior) em preparação para a dissecção larval.
4. Prepare as pipetas de cola a partir de capilar de vidro borossilicato usando um extrator de microeletrodo padrão para obter o cone e o tamanho da ponta desejados.
5. Quebre suavemente a ponta da micropipeta e, na outra extremidade, prenda 2 pés de tubo de plástico flexível (1/32" de diâmetro interno, ID; 3/32" de diâmetro externo, OD; parede de 1/32"; Tabela de Materiais) com encaixe bucal (ponta de pipeta P2).
6. Encha um pequeno recipiente (tampa do tubo Eppendorf de 0,6 mL) com um pequeno volume (~ 20 μL) de cola (Tabela de Materiais) em preparação para a dissecção larval.
7. Encha a câmara com solução salina (em mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarose e 5 ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) pH 7.2.
8. Adicione o anticorpo anti-peroxidase de rabanete (HRP) conjugado ao Alexa Fluor 647 (anti-HRP: 647; diluir 1:10 de um estoque de 1 mg / mL) para marcar o terminal pré-sináptico da junção neuromuscular (NMJ) durante a dissecção.
9. Usando um pincel fino (tamanho 2), remova uma larva de terceiro ínstar errante do frasco de alimento e coloque-a sobre a lamínula revestida de elastômero.
10. Encha a ponta da micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola usando pressão de ar negativa gerada pela boca com acessório (etapa 1.5).
11. Posicione a larva com o lado dorsal para cima com uma pinça e cole a cabeça na lamínula revestida de elastômero com uma pequena gota de cola usando pressão de ar positiva pela boca.
12. Repita este procedimento com a extremidade posterior da larva, certificando-se de que o animal esteja esticado entre os dois acessórios de cola.
13. Usando tesouras (lâminas 3 mm; Tabela de Materiais), faça um corte horizontal (~ 1 mm) na parte posterior e um corte vertical ao longo da linha média dorsal.
14. Usando uma pinça fina (# 5, Tabela de Materiais), remova suavemente a traqueia dorsal, o intestino, o corpo gorduroso e outros órgãos internos que cobrem a musculatura.
15. Repita o procedimento de colagem para as quatro abas da parede do corpo, certificando-se de esticar suavemente a parede do corpo horizontal e verticalmente.
16. Levante o cordão nervoso ventral (VNC) usando uma pinça, corte cuidadosamente os nervos motores com uma tesoura e, em seguida, remova completamente o VNC.
17. Substitua a solução salina de dissecção por solução salina livre de Ca²⁺ (igual à solução salina de dissecção acima sem o CaCl₂) para interromper o ciclo da vesícula sináptica (SV).

2. Imagem: Microscopia Confocal

1. Use um microscópio confocal vertical com uma objetiva de imersão em água de 40X para obter imagens da fluorescência do corante NMJ (outros microscópios podem ser usados).
2. Imagem do músculo 4 NMJ dos segmentos abdominais 2-4 (outras NMJs podem ser visualizadas) e colete imagens usando software apropriado (Tabela de Materiais).
3. Use um laser HeNe 633 nm para excitar HRP:647 (com filtro passa-longo > 635 nm) e um laser Argon 488 nm para excitar FM1-43 (com filtro passa-banda 530-600 nm).
4. Determine operacionalmente o ganho e o deslocamento ideais para ambos os canais.
   nota: Essas configurações permanecerão constantes durante o restante do experimento.
5. Pegue uma pilha Z confocal por todo o NMJ selecionado do topo para a parte inferior do terminal sináptico marcado com HRP.
6. Observe cuidadosamente a imagem do NMJ (segmento, lado e músculo) para garantir o excesso exatamente no mesmo NMJ após a descarga do corante FM.

3. Estimulação de Channelrhodopsin FM Dye Loading

1. Aumentar as larvas que expressam ChR2 em alimentos contendo o cofator ChR2 all-trans retinal (dissolvido em etanol; concentração final de 100 μM).
2. Coloque a preparação larval na câmara de plexiglass em um estágio de microscópio de dissecção equipado com uma porta de câmera.
3. Conecte um LED azul (470 nm; Tabela de Materiais) a um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmera.
4. Focalize o feixe de luz LED azul na função larval dissecada usando a função de zoom do microscópio.
5. Substitua a solução salina livre de Ca²⁺ na preparação larval pela solução salina FM1-43 acima (4 μM; 1 mM CaCl₂) no estágio optogenético.
6. Defina os parâmetros do LED usando o estimulador (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2)).
7. Inicie a estimulação luminosa e acompanhe com um temporizador para a duração pré-determinada do período de estimulação optogenética (por exemplo, 5 min; Figura 2).
8. Quando o cronômetro parar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua por solução salina livre de Ca²⁺ para interromper o ciclo SV.
9. Lave em rápida sucessão com o soro fisiológico livre de Ca²⁺ (5x por 1 min) para garantir que a solução de corante FM seja completamente removida.
10. Mantenha a preparação larval em solução salina fresca livre de Ca²⁺ para imagens imediatas com o microscópio confocal usando o protocolo de imagem.
11. Observe cuidadosamente a imagem do NMJ (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso exatamente ao mesmo NMJ após a descarga do corante FM.

4. Estimulação de Channelrhodopsina: Descarga de corante FM

1. Substitua a solução salina livre de Ca²⁺ por solução salina comum (sem corante FM1-43) no estágio do microscópio de dissecção com o LED da porta da câmera focado na larva.
2. Defina os parâmetros do estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2).
3. Inicie a estimulação luminosa e acompanhe com um temporizador para a duração pré-determinada do período de estimulação optogenética (por exemplo, 2 min; Figura 2).
4. Quando o período do temporizador terminar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua por solução salina livre de Ca²⁺ para interromper o ciclo de SV.
5. Lave em rápida sucessão com solução salina livre de Ca²⁺ (5x por 1 min) para garantir que o corante externo seja completamente removido.
6. Manter a preparação larval em solução salina fresca livre de Ca²⁺ para aquisição imediata de imagens com o microscópio confocal.
7. Certifique-se de obter a imagem da fluorescência do corante FM1-43 no mesmo NMJ observado acima usando as mesmas configurações confocais.

Resultados

Figura 1: Fluxograma do protocolo de carregamento de corante FM1-43 no Drosophila NMJ. A dissecção da cola larval produz uma preparação de neuromusculatura achatada, com o cordão nervoso ventral (VNC) projetando nervos segmentares da linha média ventral (Vm) para as matrizes musculares da parede corporal repetidas hemissegmentalmente (etapa a). O VNC é cortado e toda a dissecção larval é então incuba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de elastômero de silicone SylGard 184	Fisher Científico	NC9644388	Para colocar a tampa de vidro para dissecações
Vidro de cobertura do microscópio 22x22-1	Marca de pescador	12-542-B	Para colocar o SylGard para dissecações
Placa Quente Superior de Alumínio Tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Para curar o SylGard
Câmara de dissecção de vidro plexi	N/A	N/A	artesanal
Capilares de vidro borossilicato	WPI	1B100F-4	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Extrator de micropipeta baseado em laser	Instrumento Sutter	P-2000	Para fazer micropipetas de sucção e cola
Tubulação de laboratório Tygon E-3603	Fornecimento de componentes Co.	TET-031A	Para boca e pipeta de sucção
Ponteira de pipeta P2	EUA Científico	1111-3700	Para pipeta bucal
Tampa do tubo Eppendorf de 0,6 mL	Fisher Científico	05-408-120	Usado para colocar cola para dissecação
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Cola usada para dissecações
Cloreto de potássio	Fisher Científico	Pág. 217	Forsalina
cloreto de sódio	Millipore Sigma	S5886	Para solução salina
Cloreto de magnésio	Fisher Científico	M35-500	Para solução salina
Cloreto de cálcio di-hidratado	Millipore Sigma	C7902	Para solução salina
sacarose	Fisher Científico	S5-3	Para solução salina
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para rotular membranas neuronais
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solução salina
pincel	Winsor & Newton	94376864793	Para manipular as larvas
Pinças Dumont Dumostar #5	WPI	500233	Usado durante a dissecção
Microtesoura McPherson-Vannas de 7 cm (lâminas de 3 mm)	WPI	Rolamento 14177	Usado durante a dissecção
FM1-43	Fisher Científico	T35356	Corante de estiril fluorescente
Temporizador digital	VWR	Nº 62344-641	Para cronometrar a carga/descarga de corante FM
LSM 510 META microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss		Para obter imagens dos marcadores fluorescentes
Zen 2009 SP2 versão 6.0	Zeiss		Software para imagens em confocal
Laser HeNe 633nm	Lasos	Para excitar HRP:647 durante a imagem
Laser de argônio 488nm	Lasos		Para excitar o corante FM durante a imagem
Micro-Forja	WPI	MF200	Para disparar micropipetas de vidro polido
estimulador	grama	S48	Para controlar o LED e a estimulação elétrica
Totalmente trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Cofator essencial para ChR2
Microscópio Zeiss Stemi com porta de câmera	Zeiss	2000-C	Usado durante a estimulação da channelrhodopsin
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Usado para ativação de ChR
Driver de LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Para controlar o LED
Fonte de alimentação LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar o LED
Medidor de energia e potência óptica	ThorLabs	PM100D	Para medir a intensidade do LED
Objetiva de imersão em água Achroplan 40X	Zeiss	Usado durante estimulação elétrica e imagens confocais