1. Dissecção de cola larval
- Misture bem 10 partes da base de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura de elastômero de silicone do kit de elastômero (Tabela de Materiais).
- Cobrir lamínulas de vidro de 22 x 22 mm com elastómero e catalisar numa placa quente a 75 °C durante várias horas (até deixar de ficar pegajosa ao toque).
- Coloque uma única lamínula de vidro revestida com elastômero na câmara de dissecação de plexiglass feita sob medida (Figura 1, parte inferior) em preparação para a dissecção larval.
- Prepare as pipetas de cola a partir de capilar de vidro borossilicato usando um extrator de microeletrodo padrão para obter o cone e o tamanho da ponta desejados.
- Quebre suavemente a ponta da micropipeta e, na outra extremidade, prenda 2 pés de tubo de plástico flexível (1/32" de diâmetro interno, ID; 3/32" de diâmetro externo, OD; parede de 1/32"; Tabela de Materiais) com encaixe bucal (ponta de pipeta P2).
- Encha um pequeno recipiente (tampa do tubo Eppendorf de 0,6 mL) com um pequeno volume (~ 20 μL) de cola (Tabela de Materiais) em preparação para a dissecção larval.
- Encha a câmara com solução salina (em mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacarose e 5 ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) pH 7.2.
- Adicione o anticorpo anti-peroxidase de rabanete (HRP) conjugado ao Alexa Fluor 647 (anti-HRP: 647; diluir 1:10 de um estoque de 1 mg / mL) para marcar o terminal pré-sináptico da junção neuromuscular (NMJ) durante a dissecção.
- Usando um pincel fino (tamanho 2), remova uma larva de terceiro ínstar errante do frasco de alimento e coloque-a sobre a lamínula revestida de elastômero.
- Encha a ponta da micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola usando pressão de ar negativa gerada pela boca com acessório (etapa 1.5).
- Posicione a larva com o lado dorsal para cima com uma pinça e cole a cabeça na lamínula revestida de elastômero com uma pequena gota de cola usando pressão de ar positiva pela boca.
- Repita este procedimento com a extremidade posterior da larva, certificando-se de que o animal esteja esticado entre os dois acessórios de cola.
- Usando tesouras (lâminas 3 mm; Tabela de Materiais), faça um corte horizontal (~ 1 mm) na parte posterior e um corte vertical ao longo da linha média dorsal.
- Usando uma pinça fina (# 5, Tabela de Materiais), remova suavemente a traqueia dorsal, o intestino, o corpo gorduroso e outros órgãos internos que cobrem a musculatura.
- Repita o procedimento de colagem para as quatro abas da parede do corpo, certificando-se de esticar suavemente a parede do corpo horizontal e verticalmente.
- Levante o cordão nervoso ventral (VNC) usando uma pinça, corte cuidadosamente os nervos motores com uma tesoura e, em seguida, remova completamente o VNC.
- Substitua a solução salina de dissecção por solução salina livre de Ca2+ (igual à solução salina de dissecção acima sem o CaCl2) para interromper o ciclo da vesícula sináptica (SV).
2. Imagem: Microscopia Confocal
- Use um microscópio confocal vertical com uma objetiva de imersão em água de 40X para obter imagens da fluorescência do corante NMJ (outros microscópios podem ser usados).
- Imagem do músculo 4 NMJ dos segmentos abdominais 2-4 (outras NMJs podem ser visualizadas) e colete imagens usando software apropriado (Tabela de Materiais).
- Use um laser HeNe 633 nm para excitar HRP:647 (com filtro passa-longo > 635 nm) e um laser Argon 488 nm para excitar FM1-43 (com filtro passa-banda 530-600 nm).
- Determine operacionalmente o ganho e o deslocamento ideais para ambos os canais.
nota: Essas configurações permanecerão constantes durante o restante do experimento.
- Pegue uma pilha Z confocal por todo o NMJ selecionado do topo para a parte inferior do terminal sináptico marcado com HRP.
- Observe cuidadosamente a imagem do NMJ (segmento, lado e músculo) para garantir o excesso exatamente no mesmo NMJ após a descarga do corante FM.
3. Estimulação de Channelrhodopsin FM Dye Loading
- Aumentar as larvas que expressam ChR2 em alimentos contendo o cofator ChR2 all-trans retinal (dissolvido em etanol; concentração final de 100 μM).
- Coloque a preparação larval na câmara de plexiglass em um estágio de microscópio de dissecção equipado com uma porta de câmera.
- Conecte um LED azul (470 nm; Tabela de Materiais) a um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmera.
- Focalize o feixe de luz LED azul na função larval dissecada usando a função de zoom do microscópio.
- Substitua a solução salina livre de Ca2+ na preparação larval pela solução salina FM1-43 acima (4 μM; 1 mM CaCl2) no estágio optogenético.
- Defina os parâmetros do LED usando o estimulador (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2)).
- Inicie a estimulação luminosa e acompanhe com um temporizador para a duração pré-determinada do período de estimulação optogenética (por exemplo, 5 min; Figura 2).
- Quando o cronômetro parar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua por solução salina livre de Ca2+ para interromper o ciclo SV.
- Lave em rápida sucessão com o soro fisiológico livre de Ca2+ (5x por 1 min) para garantir que a solução de corante FM seja completamente removida.
- Mantenha a preparação larval em solução salina fresca livre de Ca2+ para imagens imediatas com o microscópio confocal usando o protocolo de imagem.
- Observe cuidadosamente a imagem do NMJ (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso exatamente ao mesmo NMJ após a descarga do corante FM.
4. Estimulação de Channelrhodopsina: Descarga de corante FM
- Substitua a solução salina livre de Ca2+ por solução salina comum (sem corante FM1-43) no estágio do microscópio de dissecção com o LED da porta da câmera focado na larva.
- Defina os parâmetros do estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2).
- Inicie a estimulação luminosa e acompanhe com um temporizador para a duração pré-determinada do período de estimulação optogenética (por exemplo, 2 min; Figura 2).
- Quando o período do temporizador terminar, remova rapidamente a solução de corante FM e substitua por solução salina livre de Ca2+ para interromper o ciclo de SV.
- Lave em rápida sucessão com solução salina livre de Ca2+ (5x por 1 min) para garantir que o corante externo seja completamente removido.
- Manter a preparação larval em solução salina fresca livre de Ca2+ para aquisição imediata de imagens com o microscópio confocal.
- Certifique-se de obter a imagem da fluorescência do corante FM1-43 no mesmo NMJ observado acima usando as mesmas configurações confocais.
