Implantando um eletrodo no núcleo subtalâmico de um rato

Resumo

Fonte: Fluri, F., et al., Implantação guiada por microeletrodos de eletrodos no núcleo subtalâmico de ratos para estimulação cerebral profunda de longo prazo. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra um procedimento para implantar um eletrodo no núcleo subtalâmico de um rato para fornecer estímulos elétricos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Anestesia

1. Verifique o sistema anestésico para garantir o fornecimento adequado de gás (oxigênio) e isoflurano durante o procedimento. Conecte o nariz com a barra incisiva do instrumento estereotáxico e ajuste a barra incisiva em -3,3 mm.
2. Ligue o gás de alimentação (2 L/min). Coloque o rato em uma caixa e feche a parte superior. Ligue o vaporizador de isoflurano a 3,5%.
3. Quando o rato estiver deitado, troque o sistema para que o gás anestésico flua para o nariz, que é fixado à barra incisiva.
4. Remova o rato da câmara da caixa e raspe a área entre as orelhas e os olhos; usando um cotonete embebido em Jodosept PVP, limpe a área raspada para remover qualquer cabelo solto.
5. Posicionar o rato no cone nasal (Figura 1) e continuar a anestesia com isoflurano 2,5% em O₂ (1 L/min). Verifique o nível de anestesia beliscando a área interdigital. Se o rato for anestesiado adequadamente, os reflexos defensivos (ou seja, retirada do pé) são abolidos.
6. Monitore a respiração e a resposta à estimulação durante o procedimento e ajuste o vaporizador conforme necessário.
7. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Um sistema de aquecimento controlado por feedback monitora e mantém a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C.

2. Cirurgia

1. Mantenha o campo cirúrgico estéril durante toda a cirurgia. Uma vez que as mãos do cirurgião e o campo cirúrgico estejam estéreis, mova-se apenas com cuidado e lembre-se de não quebrar a esterilidade. Isso inclui ter um campo estéril (por exemplo, cortinas estéreis à prova d'água) no qual se pode colocar instrumentos.
2. Injete 0,2 ml de mepivacaína por via subcutânea no centro da área depilada. A mepivacaína é um anestésico local que tem uma duração de ação de até 3 horas. Ele irá anestesiar ainda mais a área cirúrgica.
3. Usando um bisturi, faça uma incisão na linha média começando entre as orelhas e estendendo-se até 2 cm. Certifique-se de que o periósteo (membrana brilhante sob a pele) também seja incisado. Exponha o crânio com quatro pinças (Figura 2).
4. Usando um cotonete, remova suavemente o periósteo até que as suturas coronal e sagital estejam expostas; em seguida, estance o sangue com algodão.
5. Determine as coordenadas do bregma usando uma agulha fixada em um suporte de sonda e, em seguida, marque a ponta da agulha com uma caneta hidrográfica preta. Usando os parafusos de acionamento anterior/posterior (AP), linha média/lateral (ML) e dorsoventral (DV), posicione a ponta da agulha diretamente sobre o bregma.
6. Faça as leituras da escala de nônio AP e ML: subtraia 3.6 mm da leitura AP e 2.5 mm da leitura ML para implantação do eletrodo no STN direito ou adicione 2.5 mm para implantação do eletrodo no STN esquerdo. Esta posição será marcada pelo corante da caneta hidrográfica após abaixar a ponta da agulha até a superfície do crânio.
7. Prenda a broca odontológica no suporte da sonda grande do instrumento estereotáxico. Mova a broca dentária para a área calculada – ou seja, o ponto marcado no crânio. Olhando pelo microscópio, faça um orifício (diâmetro de cerca de 1 mm) no crânio até que a dura-máter fique visível (o crânio tem cerca de 1 mm de espessura). Retraia a dura-máter usando uma pinça de microdissecção ou uma agulha estéril. A dura-máter é resistente o suficiente para destruir a ponta do eletrodo.
8. Faça um furo com a broca dentária em cada escama frontal e na escama interparietal oposta ao orifício do eletrodo. Desconecte o suporte da sonda do instrumento estereotáxico. Não perfure uma sutura do crânio, pois os vasos venosos seguem as suturas sob o crânio.
9. Aparafuse um parafuso ósseo em cada um dos cinco orifícios. Evite rosquear os parafusos muito fundo. Para parafusos de aço inoxidável (M1.6), 2 a 3 voltas do parafuso segurarão adequadamente o parafuso sem pressionar o cérebro. O número de voltas dependerá do passo do parafuso. Prenda o suporte da sonda com o eletrodo no micromanipulador (Figura 3).
10. Usando os parafusos de acionamento AP, ML e DV, mova o suporte da sonda com o eletrodo até que a ponta esteja quase tocando o bregma. Observe as leituras da escala de nônio AP, ML e DV no bregma. Quando as leituras forem feitas, levante o eletrodo alguns milímetros para evitar que o eletrodo raspe o crânio durante o movimento. Para determinar as coordenadas da posição em que o eletrodo deve ser inserido no orifício, adicione 3.6 mm à leitura AP e adicione (ou subtraia) 2.5 mm à leitura ML.
11. Usando os parafusos de acionamento AP e ML, mova o eletrodo para a posição calculada. Neste ponto, a ponta do eletrodo deve estar situada diretamente sobre o orifício do eletrodo perfurado. Em seguida, olhando pelo microscópio, abaixe o eletrodo até o nível da dura-máter (Figura 4). Este nível serve como um nível zero na direção DV. Depois disso, insira suavemente a ponta do eletrodo no cérebro olhando pelo microscópio.
12. Conecte o pino do eletrodo ao conector do sistema de gravação. Coloque uma gaiola de Faraday (ou substitua-a por papel alumínio) sobre o rato no instrumento estereotáxico (Figura 5). Aterre o instrumento estereotáxico com o contrapeso da sala em que está sendo trabalhada.
13. Inicie o sistema de gravação. Se disponível, use também um alto-falante para obter um sinal acústico de descargas/pomadas de unidades individuais enquanto avança o eletrodo.
14. Insira lentamente o eletrodo no cérebro registrando a atividade elétrica enquanto avança o eletrodo. A uma profundidade entre 7,5 e 8,1 mm da dura-máter, a atividade elétrica específica do STN é geralmente detectável (Figura 6). A atividade típica dos neurônios no STN é caracterizada por um padrão de disparo irregular e uma alta taxa de disparo (frequência média: 40,9 ± 12,9 Hz).
15. Durante a gravação, reduza a anestesia o máximo possível (por exemplo, para 0,8–1,0%); animais com baixo teor de anestesia mostram atividade cerebral elétrica mais clara.
16. Limpe qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano que foi deslocado da superfície do crânio quando o eletrodo foi abaixado.
17. Misture uma pequena quantidade de cimento dentário e aplique ao redor do eletrodo e ao redor de quatro dos cinco parafusos usando uma pequena espátula (Figura 7). O quinto parafuso será usado para fixar o fio terra do plugue.
18. Desconecte o pino do eletrodo do porta-eletrodo e conecte o sistema de registro quando o cimento dental estiver fixado.
19. Desaperte o parafuso que não foi fixado por cimento dentário. Coloque o plugue no pino do eletrodo. Fixe o fio terra do plugue com o quinto parafuso (Figura 8).
20. Misture o cimento dental e aplique-o ao redor do plugue. À medida que o cimento engrossa, molde-o ao redor do plugue para formar uma tampa. Evite bordas afiadas do cimento dental que possam prejudicar o animal e remova-as durante o endurecimento (Figura 9A e B).
21. Desbride as bordas da ferida e feche-as com uma sutura na frente e atrás da tampa. Em seguida, desinfete as bordas da ferida.
22. Conecte o plugue do cabeçote ao fio que está fixado em um giro. Remova o rato do instrumento estereotáxico.
23. Aplique tramadol (12,5 mg/kg, por via intraperitoneal) no final da intervenção e depois uma vez ao dia por 2-3 dias. Coloque o rato em uma gaiola limpa com suporte térmico, fixe o giro nesta gaiola (Figura 10) e inspecione-o cuidadosamente por 1 hora.
24. Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

Resultados

Figura 1. Fixação da cabeça no instrumento estereotáxico. O rato é fixado pelas barras auriculares da estrutura estereotáxica, bem como pela máscara de anestesia gasosa.

Figura 2. Expondo o crânio. Após uma incisão na ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Eletrodo Pt/Ir	FHC Inc.	UE	Feito sob medida: Especificação: UEPSEGSECN1M
Plugues	GT Labortechnik (Arnstein/Alemanha)
Cabeçalho de pino	DISTRELEC	143-95-324	de uma linha, 90° 1x3 datamate, Tipo M80-8420342
soquete	DISTRELEC	143-95-621	Single-row, em linha reta 2 milímetros pólo no.1x3 datamate, tipo M80-8400342
Mola de aço inoxidável	Plásticos ONE	SS0102	Parte-#: .120 X .156 ID da mola (mm): 3.0 Diâmetro externo da mola (mm): 4.0
Cimento dentário/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Líquido, 500 ml
Cimento dentário/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Pó, rosa, 500g
Parafuso de cabeça	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacaína 1%	AstraZeneca		PZN03338515
epinefrina	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Cloridrato de tramadol	Rotexmedica		Rolamento 38449.00.00