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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparando o animal:
- Anestesiar o rato com um inalante (isoflurano) a 1-2% administrado para efeito ou por injeção (cetamina, xilazina, acepromazina). A dosagem da anestesia injetável é a seguinte: 95,0 mg/kg de cetamina, 10,0 mg/kg de xilazina, 0,075 mg/kg de acepromazina.
nota: Usamos com sucesso as abordagens anestésicas inalantes e injetáveis ao conduzir este protocolo de registro CMAP, sem preferência.
- O animal deve ser mantido na profundidade anestésica apropriada antes do início da cirurgia, até a conclusão da cirurgia e até que a buprenorfina pós-operatória faça efeito. Confirme a anestesia adequada por pinça breve do dedo do pé para determinar se uma resposta de abstinência não é obtida. Além disso, teste o reflexo da córnea com um cotonete. Durante todo o procedimento cirúrgico, determine se a frequência cardíaca e respiratória não aumentaram, o que sugere que a profundidade do anestésico se tornou muito leve.
- Aplique pomada veterinária nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- O cirurgião deve lavar as mãos com um desinfetante (esfoliante com clorexidina) antes de iniciar a cirurgia. O cirurgião deve usar luvas estéreis, máscara facial e avental ou jaleco limpo. Todos os instrumentos devem ser lavados e autoclavados antes da cirurgia. Adicione uma tira indicadora de esterilização dentro do kit de instrumentos antes de autoclavar no nível dos instrumentos para verificar se a esterilização está concluída. O cirurgião deve verificar se toda a linha da tira é preta antes de iniciar a cirurgia. Prenda também a parte externa da caixa com fita autoclave indicadora. Se a cirurgia for realizada em vários animais no mesmo dia, limpe os instrumentos entre as cirurgias e esterilize em um esterilizador de esferas de vidro. Se necessário, esterilize ambas as extremidades do instrumento no esterilizador de esferas de vidro, colocando a alça do instrumento no esterilizador pelo tempo apropriado, removendo o instrumento com um hemostático estéril, resfriando-o em um campo estéril e, em seguida, colocando a extremidade funcional do instrumento no esterilizador de esferas de vidro pelo período apropriado.
- Uma vez que o animal esteja anestesiado, coloque-o na prancha cirúrgica com a superfície dorsal para baixo e o abdômen voltado para cima para que a fita possa ser usada para prender os membros anteriores do animal à prancha cirúrgica.
- Raspe a superfície ventral caudalmente começando na base do crânio e certifique-se de que a área ao redor do abdômen em ambos os lados da linha média seja raspada, dependendo de qual hemidiafragma está sendo registrado. Aplique iodopovidona na superfície raspada da pele.
2. Preparação para gravações CMAP:
- Após a preparação do animal, coloque o eletrodo terra por via subcutânea na cauda (Figura 1).
- Coloque o eletrodo de referência por via subcutânea na região abdominal inferior contralateral.
- Coloque o gel condutor na tira de superfície autoadesiva ou no eletrodo de gravação de disco (dimensões do eletrodo da tira de superfície: 0.5 x 3 cm) e, em seguida, coloque o eletrodo de superfície transversalmente ao longo da margem costal unilateral.
- Coloque os eletrodos estimulantes por via transcutânea a 0,5 cm de distância lateral à traqueia e superior à clavícula. Insira os eletrodos com aproximadamente 1.0 cm de profundidade na pele. Prenda os eletrodos manualmente para que sua localização não se mova com estímulos subsequentes.
nota: Eletrodos de estimulação de ângulo 90° em relação à pele no local de inserção.
3. Registros do Potencial de Ação Muscular Composto (CMAP):
- Obter registros eletrofisiológicos usando um estimulador/amplificador seguido de análise de dados assistida por computador.
- Os parâmetros de estímulo da estimulação de tração única devem ser pulsos supramáximos de 0,5 ms, 1,0 Hz. A amplitude do estímulo deve estar entre 6,0 e 8,0 V (Figura 2A).
nota: Dentro de um experimento, use uma intensidade de estímulo com a mesma amplitude entre os animais. O objetivo é maximizar a amplitude de resposta usando a amplitude mínima de estimulação. É importante notar que a resposta inicial que ocorre no momento da estimulação é um artefato de estimulação. Além disso, deve-se tomar cuidado para obter uma resposta CMAP precedida por uma linha de base estável/plana após o artefato de estimulação, que é seguida pela resposta rápida da CMAP. Para obter tal resposta, pode ser necessário reposicionar os eletrodos de estimulação e/ou registro.
- Aguarde 30 segundos entre as estimulações e repita 10 estimulações seguidas para obter a resposta média (Figura 2B-C). Meça a amplitude da linha de base ao pico (Figura 2A). Realize a estimulação do nervo frênico durante a fase do ciclo respiratório do animal em que o nervo/diafragma frênico não está ativado. O procedimento pode ser repetido no mesmo animal para o hemidiafragma contralateral.
- Após a sessão final de registro do CMAP, perfundir o animal se a coloração da junção neuromuscular do diafragma (NMJ) for realizada. Realize gravações CMAP repetidamente no mesmo animal aproximadamente uma vez por semana (ou em intervalos de escolha).
- Após os registros CMAP de sobrevivência, permita que o animal se recupere em uma almofada de aquecimento de água morna circulante e monitore continuamente durante a recuperação até ficar acordado e esternalmente reclinado. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Uma vez reclinado esternalmente, monitore o animal a cada 12 horas durante as primeiras 48 horas (uma vez ao dia a partir de então). Se o animal parecer desidratado (pele flácida, apática), administre fluidos (solução de ringer com lactato; por via subcutânea; 1-2 ml por injeção, com os locais alternados; 2 vezes ao dia) até que o peso pós-cirúrgico e a perda de líquidos se estabilizem. Forneça aos animais alimentos amolecidos em pratos pequenos durante o período pós-operatório agudo, se necessário, para incentivar a alimentação se eles não conseguirem alcançar o alimentador da tampa da barra de arame.
- Administre buprenorfina na dose de 0,05 mg / kg antes do final da cirurgia e, em seguida, em intervalos de 12 horas nas primeiras 24 horas (e dependendo dos sinais de dor / estresse a partir de então) por meio de injeção subcutânea (local girado). Se forem observados sinais de dor ou angústia depois disso, trate os animais com buprenorfina. Os sinais indicativos de dor/angústia incluem falta de atividade, vocalizações, falta de comer ou beber (desidratação), perda excessiva de peso, defesa, roer ou coçar excessivamente no local da incisão. Critérios adicionais usados na determinação da dor e angústia incluem falta de resposta a estímulos estranhos, vocalização transitória ou não provocada, respiração difícil ou anormal, secreção naso-ocular marrom-avermelhada persistente, piloereção acentuada. Monitore também evidências de falta de higiene que sugiram animais doentes. Se o animal ainda estiver em perigo após 72 horas de tratamento (de acordo com os critérios de dor/estresse descritos acima e após receber o protocolo analgésico descrito acima), eutanasiar o animal.
