in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Resumo

Fonte: Hancock, C. E. et al., Imagem Óptica de Cálcio In Vivo da Plasticidade Sináptica Induzida por Aprendizagem em Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

Protocolo

1. Moscas-das-frutas transgênicas, Drosophila melanogaster

1. Moscas virgens e machos fêmeas cruzadas (criadas a 25 ° C em 60% de umidade relativa em um ciclo claro / escuro de 12 h) carregando as construções Gal4 e UAS desejadas, respectivamente, para produzir moscas nas quais neurônios específicos de interesse expressam um indicador de cálcio geneticamente codificado.
2. Envelheça a progênie feminina do cruzamento acima até que esteja na faixa de 3-6 dias após a eclosão. As moscas fêmeas são preferíveis por causa de seu tamanho ligeiramente maior.

2. Preparação da mosca-da-fruta para imagens de cálcio in vivo

1. Selecione uma única mosca fêmea e anestesiar no gelo por não mais de 5 min.
2. Usando uma pinça fina, coloque a mosca na câmara de imagem (demonstrada na Figura 1c). Certifique-se de que o tórax e as pernas estejam em contato com os fios elétricos no fundo da câmara e que a cabeça esteja plana. Fixe a posição da mosca usando fita adesiva transparente.
   nota: Este protocolo requer uma câmara personalizada na qual as moscas são fixadas, com a cápsula da cabeça acessível para abertura, e as moscas capazes de receber estímulos de odor nas antenas e choques elétricos no tórax e nas pernas (Figura 1).
3. Usando uma lâmina de bisturi cirúrgica fixada ao cabo do bisturi (ver Tabela de Materiais), corte uma janela na fita ao redor da cabeça da mosca, deixando as antenas cobertas e apenas a porção mais anterior do tórax exposta.
4. Cerque as laterais e a parte de trás da cabeça com cola de cura de luz azul, cuidadosamente manipulada usando um alfinete de inseto preso por mandíbulas côncavo-convexas. Fixe a cola usando uma lâmpada LED emissora de luz azul.
5. Verifique se a cola está completamente endurecida e limpe qualquer resíduo de cola não endurecida da superfície dorsal da cabeça da mosca.
6. Aplique uma gota de solução de Ringer (consulte a Tabela de Materiais) para cobrir a cutícula exposta da cabeça.
7. Usando uma facada de lâmina muito fina, corte a cutícula. Para a remoção mais eficiente da cutícula, primeiro corte a parte posterior da cabeça usando os ocelos como ponto de partida. Em seguida, corte cada lado, medial aos olhos, para formar uma aba da cutícula que pode ser facilmente arrancada com uma pinça.
8. Remova qualquer excesso de cutícula que possa bloquear a região cerebral de interesse.
9. Limpe cuidadosamente a superfície dorsal de qualquer traqueia usando uma pinça fina, evitando a ruptura do próprio tecido cerebral. Remova e atualize a solução de Ringer (consulte a Tabela de Materiais) conforme necessário para limpar a área de detritos teciduais.
10. Coloque a agulha de liberação de odor hipodérmico em uma posição a aproximadamente 1 cm da cabeça da mosca. Certifique-se de que não haja nada que possa obstruir a entrega de odores às antenas.
11. Ao microscópio, conecte a câmara de imagem ao sistema de entrega de odor por meio da agulha hipodérmica de entrega de odor.
12. Para permitir que a mosca se recupere totalmente da anestesia e da cirurgia e se adapte ao fluxo de ar, implemente um período de descanso de 10 minutos nesta fase.

3. Imagem de cálcio in vivo

1. Use um microscópio multifotônico equipado com um laser infravermelho e uma objetiva de imersão em água (consulte a Tabela de Materiais), instalado em uma mesa isolada por vibração. Para a visualização de indicadores de cálcio baseados em proteína fluorescente verde (GFP), sintonize o laser para um comprimento de onda de excitação de 920 nm e instale um filtro passa-banda GFP.
2. Usando o botão de ajuste Z grosso, escaneie o eixo Z do cérebro e localize a região cerebral de interesse. Use a função de corte para focar a digitalização apenas nessa área para minimizar o tempo de digitalização e girar a visualização de digitalização de forma que a parte anterior da cabeça fique voltada para baixo.
3. Ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 px, a velocidade de varredura para > 4 Hz e a região de varredura (na dimensão Y) para que os neurônios de interesse sejam cobertos.

4. Visualização de transientes de cálcio evocados por odor através do condicionamento olfatório

1. Use um sistema de entrega de odor que possa fornecer vários estímulos de odor de maneira temporalmente precisa.
   1. Use um computador adicional para controlar o dispositivo e se comunicar com o software do microscópio de imagem para coordenar os estímulos de odor com a captura de imagem durante os experimentos.
   2. Inicie um pacote de macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagem e o programa de entrega de odor (por exemplo, um pacote de macro VBA instalado no software de controle do microscópio, consulte Tabela de Materiais) que responda a um gatilho de entrada externo fornecido pelo início de um protocolo de entrega de odor em um programa separado).
2. Inicie a medição monitorando transientes de cálcio evocados por odor "pré-treinamento"/ingênuos em uma resolução de 512 x 512 px e uma taxa de quadros de 4 Hz. Forneça um estímulo de odor de 2,5 s ladeado por aquisição de imagem adicional por 6,25 s antes do início do odor (para estabelecer um valor basal F₀) e 12,5 s após o deslocamento do odor. Repita isso com um segundo odorante e depois com um terceiro odor.
3. Continue 3 min após esta medição com condicionamento clássico ("treinamento") a mosca.
   1. Selecione um dos odores apresentados na fase "pré-treino" para se tornar o odor de estímulo condicionado (CS⁺) e outro para se tornar o odor CS-. Apresente o odor CS⁺ usando o sistema de fornecimento de odor controlado por computador por 60 s ao lado de doze choques elétricos de 90 V.
   2. Após uma pausa de 60 s, apresente o odor CS- sozinho por 60 s. Use como odorantes 4-metilciclohexanol e 3-octanol. Não apresente o terceiro odor (por exemplo, 1-octen-3-ol) durante este treinamento, pois ele é usado como controle apenas antes (etapa 4.2.) e depois (etapa 4.4) da fase de treinamento.
4. Meça novamente os transientes de cálcio evocados por odor "pós-treino" repetindo o protocolo de estimulação de odor "pré-treino" (etapa 4.2.) 3 min após o término da fase de treinamento (etapa 4.3).
   nota: O tempo desta etapa deve refletir o tempo de interesse após a formação da memória (por exemplo, execute esta etapa 3-4 minutos após a etapa de condicionamento para investigar a memória de curto prazo). Normalmente, as moscas podem sobreviver por várias horas nesta preparação.
5. Salve os arquivos de imagem em um formato apropriado (por exemplo, Tiff) para análise posterior da imagem.

5. Análise de imagem

1. Para analisar imagens, abra arquivos Tiff (ou similares) no software de análise de imagens, como o Fiji.
2. Alinhe as pilhas usando um algoritmo de correção de movimento para garantir o mínimo de movimento nas direções X e Y. Descarte todas as gravações que mostrem um forte movimento no eixo Z.
3. Selecione a ferramenta de software usada para marcar uma região de interesse (ROI) ao redor da área a ser examinada. Isso deve ser o mais preciso possível para limitar a influência da fluorescência de fundo.
4. Use a respectiva ferramenta de software para extrair dados de intensidade de fluorescência temporal como arquivos de dados do ROI selecionado, de modo que um valor seja gerado para cada quadro da gravação.
5. Abra os dados usando um programa de análise de dados para calcular os valores ΔF/F₀ para cada traço de odor. F₀ = fluorescência média nos 2 s antes do início do odor. ΔF = diferença entre a fluorescência bruta num determinado fotograma e F₀. A partir desses valores, calcule um valor ΔF/F₀ para cada quadro, que pode ser plotado em relação ao tempo para refletir a fluorescência relativa durante todo o período de estímulo de odor.

Resultados

Figura 1: Construção de uma câmara de montagem e preparação de uma mosca para imagem.(a) Etapas para a construção da câmara de montagem de mosca. A base é formada por uma lâmina de microscópio padrão (1) coberta com uma malha plástica fina (2). Dois fios elétricos carregando cargas opostas (3) são colados à corrediça de cada lado. Os fios são descascados e dobrados para cruzar a corr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-Oitavo-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	O5284	Produto químico usado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	218405	Produto químico usado como odorante
4-metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	153095	Produto químico usado como odorante
Filtro passa-banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha
Fita adesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemanha		Fita adesiva transparente padrão
Mandíbulas côncavo-convexas	Ferramentas de Belas Ciências, North Vancouver, Canadá	10053-09	Porta-lâminas com garras côncavo-convexas
Pinça fina	Ferramentas de Belas Ciências, North Vancouver, Canadá	11412-11	Fórceps com ponta 0,1 x 0,06 mm
Seringa	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemanha	4665120	1.20x40mm
Pins de Inseto Minutien	Ferramentas de Belas Ciências, North Vancouver, Canadá	Nº 26002-10	Diâmetro 0,1 mm, ponta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Cola fotopolimerizável azul
Lâmina de microscópio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha	656.1	Corrediça objetiva padrão 76 x 26 mm
Óleo mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	M8410	Usado como diluente para odores
Laser Ti-Sapphire com bloqueio de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, EUA		Laser infravermelho ajustável do femtosegundo
Microscópio Multifotônico LSM 7MP equipado com detectores BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha		Microscópio multifotônico, várias empresas fornecem dispositivos semelhantes.
Objetiva de imersão em água Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha	Rolamento 421452-9900-000	Objetiva W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Solução de Ringer	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacarose, pH = 7,4
Faca	Sharpoint, Corporação de Especialidades Cirúrgicas, Reading, PA, EUA	72-1551	Profundidade de lâmina restrita reta de 5,0 mm
Lâmina de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	303	Produto nº 11
Cabo de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	907	Nº do produto 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) para receber um gatilho do dispositivo de entrega de odor e o dispositivo de aplicação de choque elétrico (fonte de alimentação) para interagir com o software ZEN da Zeiss que controla o microscópio.	Escrito sob medida e disponível mediante solicitação	n.a.	n.a.