Neuromodulação induzida por ultrassom usando um sistema de matriz de microeletrodos

Abstract

Fonte: Liang, R. et al., Neuromodulação por ultrassom focalizado de culturas neurais humanas in vitro em matrizes de microeletrodos de vários poços. J. Vis. Exp. (2024)

Este vídeo demonstra o método para induzir a modulação da atividade neural em neurônios derivados de iPSC humanos cultivados em uma matriz de microeletrodos de vários poços, ou sistema MEA usando um transdutor de ultrassom focalizado.

Protocol

1. Preparação de materiais

1. Aspire o meio de cultura e use-o para preencher um único poço em uma placa de cultura de neurônios de 24 poços com um arranjo de microeletrodos (MEA) embutido (Figura 1A).
2. Esterilize a interface do parafilme, o elástico e o cone de ultrassom focalizado (FUS) com sua membrana de borracha usando etanol a 70% por 10 min e coloque-os na capela para montagem posterior.
3. Desgaseifica 300 mL de água deionizada e 50 mL de gel de acoplamento. Centrifugue a água e o gel a 160 x g por 5 min para evitar a indução de cavitação dentro do meio de acoplamento.
   nota: A fonte original das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSCs) é de linhagens celulares GM01582 e CIPS. Em média, uma densidade de 5 x 10⁴ neurônios motores e 2,5 x 10⁴ astrócitos por poço pode ser alcançada.

2. Conexão e configuração dos periféricos

1. Prenda o cone FUS ao transdutor usando parafusos e vede o cone com uma membrana de borracha flexível em uma coifa estéril ventilada. Encha o cone com a água desgaseificada e deionizada (DG-DI) da etapa 1.3 e certifique-se de que não haja bolhas no cone para evitar cavitação.
2. Use uma haste rosqueada personalizada para prender o suporte impresso em 3D a uma moldura (Figura 1B). Posicione a estrutura de forma que a cabeça do transdutor FUS fique sobre o poço que será estimulado.
3. Use um elástico para prender o parafilme sobre o poço na placa MEA de 24 poços contendo o meio e os HiPSCs.
4. Prepare o sistema FUS conectando os componentes eletrônicos do driver de back-end do transdutor de ultrassom, neste caso, a saída de energia do transdutor (TPO), a uma tomada de 100-240 V e conectando a rede correspondente ao TPO e ao transdutor FUS. A rede correspondente garante um acoplamento elétrico eficiente entre o transdutor e o TPO.
5. Conecte o sistema MEA a uma tomada elétrica (100-240 V) (Figura 2B, Conexão 5). Conecte a porta de sincronização do sistema MEA ao TPO (Figura 2B, Conexão 3). Esta conexão sincronizará a aquisição de dados pelo sistema MEA com a estimulação FUS.
6. Coloque a placa MEA de 24 poços no sistema MEA e remova a tampa para permitir o contato direto entre o transdutor e o poço. Coloque o transdutor 5-10 mm acima da placa do poço para deixar espaço para o gel de acoplamento desgaseificado, conforme descrito na etapa 3.2 (Figura 2A e Figura 1B).

3. Estimulação e aquisição de sinais neuronais

1. Defina os parâmetros FUS no painel de controle TPO (Tabela 1).
2. Aplique o gel de acoplamento em cima do parafilme e abaixe o transdutor FUS no gel de acoplamento, garantindo o contato com o gel com bolhas de ar mínimas (Figura 1A).
3. Inicie a gravação do sistema MEA clicando no botão Iniciar na interface do usuário.
4. Inicie a sonicação FUS pressionando o botão inferior direito no TPO (Figura 2A, Rótulo 7) e aguarde pelo menos 5 minutos entre cada rodada de sonicação para permitir que os neurônios retornem ao estado basal.
5. Use o pulso de disparo gerado pelo sistema FUS para alinhar a sequência de estimulação FUS ao registro MEA (Figura 1B, Conexão 3).

Tabela 1: Parâmetros de ultrassom focalizado (FUS) definidos no TPO

parâmetro	valor
Potência máxima/canal	1.200 W
Pactual	0,749 W/canal
ISPPA	10,79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Comprimento da explosão	0,100 ms
frequência	250.00 kHz
foco	39.800 milímetros
período	20.000 ms
temporizador	60.000 s

Results

Figura 1: Neuromodulação FUS com uma matriz de microeletrodos de vários poços (MEA). (A) Esquema da configuração para neuromodulação FUS com um MEA de vários poços. As ondas acústicas geradas pelo transdutor FUS se propagam através de um cone FUS preenchido com água desgaseificada e são acopladas usando gel de ultrassom. O parafilme é preso ao poço usando um elástico para evitar cont...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema MEA	Axion Biosystem Inc.	Borda do Maestro	Taxa de amostragem: 11500 Hz
Placa MEA	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Eletrodo e poço: 16 eletrodos em 24 poços
Interface de placa de poço	Amcor Inc.	Parafilme PM996; Pág. 7793	Espessura: 127 μm
Tanque de CO2 e Regulador para cultura	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentração: 5%
Meios de Cultura	ThermoFisher Inc.	Laminina; 23017-015	Concentração: 1 μg/mL
Neurônios HiPSC	Peprotech	CIPS e derivados de GM01582; 450-10	Concentração: 10 ng/mL (consulte Taga et al [2021]13)
transdutor	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Frequência central: 250 kHz
Rede de correspondência	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedância: 50 Ω
Saída de potência do transdutor (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Versão 4.1; 020	Frequência: De 250 kHz a 2,5 MHz
membrana	McMaster Inc.	Borracha de silicone; 5542N115	Espessura: 0,0127 cm
Gel de acoplamento	Laboratório Parker Inc.	Aquasônico 100; B08DDWG GXB	Viscosidade: 130.000–185.000 policiais
Conexão ao suporte da sonda	McMaster Inc.	Haste Roscada Roubada; 90322A661	Comprimento: 1–1/2" de comprimento
Hidrofone	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Faixa: 50 kHz a 1,9 MHz
Tanque de água	Sonic Concepts Inc.	Wt	Tamanho: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Unidade de Condicionamento de Água	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Velocidade de fluxo: 50 mL / s máximo
osciloscópio	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Taxa de amostragem: Até 50 MHz
palco	Sonic Concepts Inc.	MicroEstágio; 2	Precisão: 1 μm
Folha termocrômica	TIPTEMP Inc.	Folha de cristal líquido; TLCSEN337	Faixa: 22–24 °C
computador	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3,7 GHz
Software de transferência de dados	Mathworks Inc.	LABORATÓRIO MATLAB	Versão 2021b
Software de processamento	Fundação de Software Python	pitão	Versão 3.7.10