1. Configuração antes das gravações
- Preparar as soluções de registo com as concentrações de iões indicadas no quadro 1.
- Prepare 15 mL de soluções estoque 2 M em água ultrapura para MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
- Pesar os componentes sólidos para 100 mL das soluções tamponadas intracelulares e 500 mL das extracelulares de acordo com a Tabela 1 em béqueres separados e adicionar a respectiva quantidade das soluções estoque preparadas posteriormente. Por exemplo, para o tampão intracelular, use 0,3803 g (10 mM) de EGTA (ácido etilenoglicol tetracético), 0,2383 g (10 mM) de HEPES (4- (2-hidroxietil) -1-ácido piperazineetanossulfônico) e 0,6428 g (110 mM) de NaCl e adicione 100 μL de 2 M MgCl2 e CaCl2 e 50 μL das soluções estoque 2 M KCl e CsCl.
- Adicione água ultrapura e ajuste cuidadosamente o pH usando ácidos e bases, que não interferem na medição, ou seja, não são conduzidos pelo ChR (Channelrhodopsinas), como ácido cítrico e N-metil-D-glucamina (NMG+).
- Ajustar a osmolaridade para 290 mOsm para as soluções intracelulares e 320 mOsm para as soluções extracelulares com glicose.
nota: Soluções intracelulares ligeiramente hiposmóticas aumentam a taxa de sucesso do patching.
- Filtre todas as soluções através de filtros de 0,22 μm. Armazene as soluções a 4 °C por duas semanas ou congele a -20 °C para armazenamento de longo prazo.
- Calcular potenciais de junção líquida e preparar protocolos de registro.
NOTA: A alteração da concentração de cloreto extracelular após o estabelecimento da configuração de toda a célula causa um potencial de junção líquida significativo (LJP) que deve ser corrigido. Os LJPs podem ser medidos ou calculados diretamente, aqui, a última opção é usada. Neste protocolo, será utilizada a correção online, demandando um protocolo de gravação para cada buffer externo. No entanto, para um conjunto maior de soluções externas, recomenda-se uma pós-correção do LJP para evitar falsas correções.
- Abra a calculadora de potencial de junção (JPC) e abra a caixa de diálogo 'Novo experimento'. Em seguida, selecione "Patch-clamp medições". Selecione "medições de células inteiras" e "eletrodo de solução salina padrão" e insira uma temperatura de 25 °C. Entre cada etapa, avance aceitando a seleção pressionando o botão "próximo".
NOTA: Os experimentos são realizados a uma temperatura ambiente de 25 ° C em um laboratório com ar condicionado. Certifique-se de que as soluções tampão tenham temperatura ambiente antes de iniciar os experimentos. Para variar a temperatura da amostra, um estágio ou câmara de incubação pode ser usado. A temperatura do banho pode ser frequentemente medida com um termômetro.
- Adicionar todas as concentrações individuais de aniões e catiões da solução pipetada e do tampão de cloreto elevado de acordo com as concentrações indicadas no quadro 1.
nota: O JPC calculará um LJP de -0,5 mV para as condições iniciais.
- Clique em "New Bath Solution" para inserir a composição aniônica e catiônica do tampão com baixo teor de cloreto.
nota: O JPC agora calculará um novo LJP de +12,6 mV de acordo com a solução de gravação extracelular alterada.
- Prepare dois protocolos corrigidos por LJP para as duas condições de medição, subtraindo o LJP calculado do potencial de retenção aplicado; -0,5 mV para as soluções externas de alto e +12,6 mV para as soluções externas de baixo cloreto. Assim, os protocolos iniciam com -79,5 mV (alto cloreto) e -92,6 mV (baixo cloreto), respectivamente, para obter um potencial de retenção inicial corrigido pela LJP de -80 mV em ambos os casos.
nota: As etapas a seguir se aplicam ao software de aquisição de dados mencionado na lista de materiais.
- Abra o editor de protocolo no software de aquisição. No menu "Modo", selecione "Estimulação episódica" e inclua 7 varreduras.
- Mude para o menu "Forma de onda" no editor e inclua um período de 200 ms com potencial de retenção de 0 mV seguido por um período de 2 s com potencial de retenção variável a partir de -79.5 mV para alto cloreto. Inclua um "nível Delta" de 20 mV para o segundo período para aumentar o potencial de retenção em 20 mV em cada varredura.
- Dentro das etapas de tensão do editor de forma de onda, aplique um período de iluminação de 500 ms com luz de 540 nm (3.10 mW/mm²). Para isso, altere o "padrão de bits digital" do obturador conectado que controla a fonte de luz para ficar ativo 500 ms após o segundo período descrito acima (ver 1.2.6).
nota: A intensidade da luz pode influenciar as propriedades biofísicas das correntes do canal, como amplitude ou inativação. Portanto, as densidades de potência da luz devem sempre ser relatadas. Para medir a potência da luz depois de passar por todas as ópticas e pela lamínula, use um optômetro calibrado. Para calcular a densidade de potência, determine o campo iluminado da objetiva por um micrômetro de objeto e divida a potência luminosa medida pelo campo iluminado determinado.
- Salve o protocolo para a solução extracelular com alto teor de cloreto. Modifique o protocolo e substitua o potencial de retenção de primeiro nível por -92,6 mV (baixo cloreto externo). Salve este segundo protocolo para medir a condição extracelular de baixo cloreto.
- Revestimento de lisina de lamínulas de vidro conforme protocolo adaptado.
- Coloque várias 100 lamínulas em uma placa de Petri de vidro e adicione 250 mL de HCl (1 N).
- Coloque a placa de Petri com as lamínulas em um agitador linear. Agite a 120 rpm por 72 h para limpar as lamínulas e, em seguida, enxágue com água ultrapura para neutralizar o pH.
- Mergulhe-os em um pequeno volume de etanol a 95% para limpeza adicional.
NOTA: As lamínulas limpas podem ser armazenadas em etanol a 70% antes de prosseguir. Trabalhe sob uma capela de fluxo laminar para as etapas a seguir.
- Usando um bico de Bunsen e uma pinça, acenda cada lamínula e transfira-a para uma nova placa de Petri.
- Incubar as lamínulas de vidro com uma solução estéril de poli-D-lisina de 50 μg/ml durante pelo menos 1 h (ou durante a noite) à temperatura ambiente, agitando com um agitador linear a 150 rpm.
- Lave as lamínulas com água ultrapura para remover o excesso de poli-D-lisina.
- Espalhe as lamínulas em papel estéril para secar por 10 min e exponha-as à luz ultravioleta para esterilização (pelo menos 20 min).
- Recolha as lamínulas em uma placa de Petri estéril coberta com papel alumínio até o uso.
- Preparar o ADN do gene PsACR1 fundido ao mCherry utilizando técnicas padrão de biologia molecular.
- Clone a sequência gênica otimizada para códon humano que codifica PsACR1 em um plasmídeo peGFP-C1 (promotor de CMV (citomegalovírus), resistência à canamicina) em quadro com o fluoróforo mCherry usando enzimas de restrição ou outros métodos de clonagem estabelecidos.
Nota: Outros fluoróforos também podem ser usados, mas certifique-se de ter os conjuntos de filtros correspondentes disponíveis para observar sua fluorescência ao microscópio na configuração.
- Transforme o DNA do plasmídeo em células XL1Blue E. coli quimiocompetentes por choque térmico de acordo com o protocolo padrão e coloque-as em placas de ágar (30 μg / mL de canamicina). Cultive as bactérias plaqueadas durante a noite a 37 °C.
- No dia seguinte, inocular 4 mL de meio de caldo de lisogenia suplementado com 30 μg/mL de canamicina com células de colônias únicas e incubá-las durante a noite a 37 °C e 180 rpm em uma incubadora.
- Após a incubação durante a noite, purificar o ADN plasmídico das culturas utilizando um kit disponível no mercado, de acordo com as instruções do fabricante.
- Semeie as células
NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar.
- Coloque até três lamínulas de vidro revestidas de lisina lado a lado em uma placa de Petri de 35 mm.
nota: Pressione-os suavemente contra o fundo do prato para evitar escorregar um sobre o outro.
- Semeie 1,5 x 105 células HEK (células renais embrionárias humanas) em 2 mL de meio de águia modificado padrão de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em cada placa.
- Suplementar totalmente trans retinal a uma concentração final de 1 μM. Cultivar as células durante pelo menos um dia antes de prosseguir com o passo 1.6.
- Transfectar transitoriamente as células por meio de lipofecção.
- Para cada placa de células, preparar uma solução de 2 μg de DNA plasmidial (ácido desoxirribonucléico) em 250 μL de DMEM sem FBS e 6 μL de reagente de transfecção.
- Após 15 minutos de incubação, adicione suavemente (gota a gota) a solução às células.
- Prepare pontes de ágar
- Adicione 0,75 g de agarose a 50 mL de solução estéril de cloreto de sódio (140 mM) e dissolva-a aquecendo-a no micro-ondas.
NOTA: 2 - 3 M KCl para preparação de ponte de ágar reduz ainda mais o LJP devido à maior concentração (por exemplo, difusão constante da ponte) e mobilidade igual de íons K+ e Cl-, mas foi evitado para minimizar o vazamento de íons (especialmente Cl-) na solução do banho.
- Encha as pontas da pipeta de 10 μL (ou uma mangueira de pequeno diâmetro) com a solução de agarose líquida usando uma seringa.
nota: Evite bolhas de ar na ponte.
- Depois de arrefecidas e solidificadas das pontes de ágar-ágar, conservá-las numa solução estéril de cloreto de sódio a 140 mM.
- Prepare eletrodos de gravação e banho.
- Remova os fios de prata do banho e do eletrodo de gravação da configuração do patch-clamp.
- Polir os fios com lixa para remover o cloreto de prata de experimentos anteriores. Mergulhe o fio de prata limpo em 3 M KCl e conecte-o ao pólo positivo de uma bateria de 1.5 V para revestimento eletrolítico com cloreto de prata.
NOTA: Uma fonte de alimentação de laboratório pode ser usada em vez de uma bateria.
- Puxe pipetas de remendo de baixa resistência (1,5-3,0 MΩ) dos capilares de vidro com um extrator de micropipeta e poli-las. Armazene as pipetas sem poeira para o dia da medição.
- Ligue todos os componentes de configuração para aquecer até a temperatura de trabalho 30 minutos antes das gravações. Certifique-se de que os buffers estejam em temperatura ambiente.
2. Medições de seletividade
- Inicie as gravações 24 a 48 h após a transfecção transitória das células.
- Coloque uma lamínula na câmara de medição e sele-a com silicone para evitar vazamento do tampão externo. Armazene a placa de Petri com as outras lamínulas em uma incubadora para o próximo conjunto de experimentos.
- Encha cuidadosamente a câmara com tampão extracelular (alto [Cl-]) para evitar o descolamento das células, coloque-a sob o microscópio e use a objetiva 40X para visualizar as células.
- Coloque uma ponte de ágar sobre o eletrodo do banho e coloque-o na câmara junto com o sensor de nível de fluido e a saída de perfusão do manipulador de banho.
- Troque a solução extracelular duas vezes por 1 mL de solução externa fresca (alto [Cl-]) para remover o meio de cultura residual e as células destacadas.
- Coloque as células em foco e procure uma célula transfectada (fluorescente), que precisa ser isolada de outras células. Use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja (590 nm; largura de banda de 15 nm; 100% de intensidade) para excitar e visualizar mCherry.
nota: As células HEK podem ser eletricamente acopladas às suas vizinhas por junções comunicantes, resultando em baixa resistência à membrana na configuração de toda a célula.
- Encha uma das pipetas puxadas com solução intracelular e remova as bolhas de ar virando a pipeta várias vezes.
- Monte a pipeta no suporte da pipeta e aplique um pouco de pressão positiva para evitar o entupimento da ponteira.
- Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue-a perto da célula usando o micromanipulador.
nota: As etapas a seguir se aplicam ao amplificador, aquisição de dados e software de avaliação mencionado na lista de materiais.
- Inicie o "teste de membrana" no software de aquisição de dados e aplique um passo de tensão (pulso de teste; por exemplo, 5 mV por 10 ms, linha de base em 0 mV), manual ou automaticamente por meio de software especificado usando o "modo de banho" durante a execução do "teste de membrana" no software de aquisição de dados.
- Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada (1,5-3,0 MΩ).
- Correntes de deslocamento zero ajustando o potencial da pipeta girando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador enquanto trabalha no "modo banho" do "teste de membrana".
- Estabeleça um patch na configuração de célula inteira.
NOTA: As etapas a seguir requerem a aplicação de pressão positiva e negativa fornecida à porta lateral do porta-pipetas usado. Isso pode ser feito usando uma seringa, por meio de um bocal ou um regulador de pressão controlado eletronicamente. Neste protocolo, a pressão positiva e negativa é aplicada por meio de um bocal.
- Aproxime-se lentamente da célula com a pipeta de adesivo por cima e alivie a pressão positiva antes de tocá-la.
NOTA: Quando a ponta está próxima à célula, a resistência aumentará ligeiramente; Isso é indicado por um tamanho reduzido do pulso de teste.
- Mude o "teste de membrana" de "modo de banho" para "modo de adesivo", portanto, o potencial de retenção para o potencial de repouso esperado das células (-30 a -40 mV).
- Em alguns casos, a configuração ligada à célula se forma após a liberação da pressão positiva. Caso contrário, aplique suavemente pressão negativa para auxiliar na formação do gigaseal.
nota: A configuração ligada à célula é estabelecida quando o pulso de teste é reduzido a dois pequenos picos capacitivos no início e no final do pulso e a resistência da membrana está na faixa de GΩ; tensões negativas de até -60 mV podem facilitar a formação de gigaseal.
- Compense a capacitância da pipeta girando os botões de "compensação de capacitância da pipeta" para obter uma resposta plana do pulso de teste.
- Rompa o adesivo sem destruir a vedação aplicando pulsos curtos de pressão negativa ou pressão negativa com força crescente, para obter a conformação de toda a célula.
nota: A transição bem-sucedida da configuração ligada à célula para a célula inteira é indicada por um aumento dos picos capacitivos.
- Aplique a compensação de resistência em série definindo o parâmetro de célula inteira e os ajustes de compensação do amplificador usado para fixação precisa do potencial da membrana para a tensão de retenção desejada.
- Mude o "teste de membrana" para o modo "célula inteira", no painel "Compensação de resistência em série" ligue "previsão" e "correção" em até 90% evitando ultrapassagens e oscilação da resposta capacitiva, ligue o interruptor de compensação de célula inteira e ajuste os parâmetros de célula inteira com os botões apropriados do painel frontal ("capacidade de célula inteira" e "resistência em série") do amplificador de forma iterativa para obter um ideal resposta de vedação de teste plano.
nota: Para obter uma descrição detalhada da compensação e correção da resistência em série, consulte o manual ou diretriz do amplificador, pois esse procedimento varia entre os diferentes fabricantes.
- Depois de estabelecer a configuração de células inteiras, aguarde pelo menos 2 minutos antes de gravar para garantir a reposição suficiente da solução intracelular através da pipeta de remendo.
- Registre as correntes induzidas pela luz em diferentes potenciais de retenção usando os protocolos que foram configurados anteriormente (em 1.2).
- Troque o tampão extracelular para baixo [Cl-] na câmara pelo menos cinco vezes sem destruir o remendo e registre outra relação corrente-tensão (cf. etapa 1.2) na nova concentração de cloreto.
nota: Um sistema de perfusão para troca automatizada de tampão facilita esse processo, mas não é necessário.
- Repetir o ponto 2.15. para cada condição iónica a ensaiar, mas verificar repetidamente a qualidade do penso intermédio entre as medições através de um "ensaio de membrana" acima descrito.
nota: Para garantir uma tensão de membrana precisa e uma composição de íons intracelular estável, a resistência da membrana deve estar acima de 500 MΩ, enquanto a resistência de acesso não deve ultrapassar 10 MΩ, ver 2.12.6). Não se esqueça de desligar a compensação do parâmetro de célula inteira para o teste de membrana.
- Repetir 2.2 a 2.15 para várias células, mas retirar uma nova lamínula para cada série de ensaios para garantir a salubridade das células.
Tabela 1: Composição Iônica das Soluções Tamponadas. Composição de tampões intracelulares (intra.) e extracelulares (extra.) para experimentos de seletividade de cloreto em células HEK. Abreviaturas utilizadas: ácido etilenoglicol tetracético (EGTA), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e aspartato (ASP). Todas as concentrações estão em mM.
| Intra. | extra.1 | extra.2 |
| alto cloreto | baixo cloreto | baixo cloreto |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | algarismo | algarismo | algarismo |
| MgCl2 | algarismo | algarismo | algarismo |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| ph | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| Osmolaridade | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
