Gravações perfuradas de patch-clamp de corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno

Resumo

Fonte: Iyer, M. R., et al. Isolando e Cultivando Somatas Vestibulares e Gânglios Espiral de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp. J. Vis. Exp. (2023).

Este vídeo demonstra a técnica patch-clamp para medir correntes iônicas em corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno. Ele detalha a preparação e o uso de uma pipeta de grampo de remendo polida preenchida com uma solução interna contendo anfotericina B, que perfura a membrana para permitir o movimento de íons, preservando as condições intracelulares. Os pulsos de tensão são aplicados para acionar e registrar a atividade do canal iônico, fornecendo informações sobre suas propriedades e comportamento.

Protocolo

1. Gravação

NOTA: Neste procedimento, as gravações de patch-clamp do gânglio isolado são normalmente realizadas 12-24 h após o revestimento. Outros laboratórios relataram resultados de neurônios após períodos muito mais longos em cultura.

1. Prepare a câmara de gravação
   1. Use a câmara de gravação de troca rápida (ou equivalente) que permite gravações de patch clamp diretamente na placa de cultura. Configure a câmara no microscópio invertido.
   2. Insira os pratos de cultura com fundo de vidro na câmara.
   3. Alimente a solução de L-15 através de um sistema de tubo de perfusão para a câmara de registro. Estabilize o fluxo de entrada e saída de perfusão na câmara a uma taxa de 0,5-1 mL por minuto.
2. Prepare a solução interna para carregar eletrodos
   1. Descongelar uma alíquota da solução interna de remendo perfurado. Aloque 2,5 ml da solução numa placa de cultura de 35 mm. Recoloque a tampa do prato de cultura e rotule como "Tip Dip". Reserve em uma zona livre de poeira, pois é muito importante manter esta solução o mais limpa possível.
   2. Pesar 1 mg de anfotericina B e adicionar 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Vortex e gire a solução até que toda a anfotericina B esteja na solução. Adicione 10 μL da solução de DMSO / anfotericina B aos 2 mL restantes da solução interna de adesivo perfurado descongelado. Retire e dissipe a solução com uma pipeta duas ou três vezes para garantir que o DMSO / anfotericina B tenha se misturado uniformemente à solução interna. A solução terá uma coloração amarelada suave.
   3. Aspire a solução interna de adesivo perfurado de anfotericina B para uma seringa de 3 mL. Adicione uma ponta de 34 G à seringa. Enrole a seringa em papel alumínio e mantenha a seringa no gelo.
      nota: Esta solução deve ser refeita a cada 2 h para garantir a eficácia da anfotericina B na perfuração da membrana celular. A anfotericina B é sensível à luz e deve ser protegida da luz usando papel alumínio ou outros métodos.
3. Gravações de patch-clamp
   1. Visualize os neurônios usando uma objetiva de 10x ou 20x. Ajuste a iluminação e otimize a óptica para ver os limites e sombras ao redor da célula.
   2. Verifique a qualidade dos neurônios isolados. Tente apenas neurônios com superfícies lisas e uniformes que não sejam muito contrastadas e tenham apenas crateras pequenas e dispersas. Além disso, certifique-se de evitar pares de neurônios, neurônios cercados por detritos ou outras células.
   3. Com ampliação de 100x, identifique um neurônio ou campo de neurônios para remendá-los e alinhá-los no centro do campo de visão.
   4. Encha a ponta da pipeta com uma solução limpa que não contenha anfotericina mergulhando a ponta (por ~ 20 s) na solução limpa que foi colocada em uma placa de cultura. A ação capilar atrairá uma pequena quantidade de solução para a ponta.
      nota: Execute esta etapa em um microscópio de dissecção estéreo, que permite determinar o quão bem a ponta segura a solução Tip Dip. Se a solução não durar ~ 10-20 s, a forma do eletrodo não é ideal. Nesse caso, reconfigure o programa de tração do eletrodo para produzir uma ponta mais longa.
   5. Em seguida, encha a parte traseira da pipeta com a solução interna contendo anfotericina. O filamento dentro da pipeta puxará a solução para encontrar a solução limpa na ponta. Deixe o filamento puxar suavemente a solução para baixo e não tente retirar as bolhas, pois isso forçará a anfotericina para a ponta muito rápido.
   6. Use uma seringa para retirar a solução que pode estar na parte de trás do eletrodo.
      nota: É muito importante trabalhar rápido deste ponto até pousar e formar uma vedação de alta resistência na célula desejada.
   7. Insira a pipeta no porta-pipetas. Verifique se a pipeta está bem ajustada no suporte para evitar o desvio da pipeta. Se a pipeta não estiver estável, troque os anéis de vedação na frente e atrás do porta-pipetas para minimizar o desvio e manter uma forte sucção. Substitua a pipeta por uma recém-cheia.
   8. Baixe a pipeta no banho da câmara de gravação.
   9. Localize a ponta da pipeta no meio do campo de view. Certifique-se de que a ponta esteja livre de bolhas de ar ou outros detritos.
   10. Aplique um passo de tensão (5 mV) no teste de membrana para monitorar a resistência da pipeta. Continue monitorando a resistência de entrada durante todo o processo de formação de uma vedação na célula.
   11. Cancele o potencial de deslocamento da pipeta, de modo que a corrente da pipeta seja zero no modo de teste de membrana do pClamp.
   12. Corrija a capacitância da pipeta usando a função de compensação rápida de capacitância no amplificador patch-clamp (mostradores rápidos Cp no painel virtual Multiclamp Commander).
   13. Mova a pipeta para a célula.
   14. Quando a pipeta estiver perto o suficiente do neurônio, mude para a objetiva de ampliação mais alta e envie a imagem através de uma câmera para um monitor (use uma objetiva de 40x, ampliação total de 400x). Ajuste a pipeta e centralize novamente o neurônio.
   15. Mova o eletrodo de gravação para perto do soma. Localize o centro do neurônio no monitor e posicione o eletrodo de registro acima do neurônio.
   16. Aproxime-se do neurônio de cima, de modo que o eletrodo pouse no centro da célula esférica. Ajuste o deslocamento da pipeta para zerar os potenciais CC constantes no sistema.
   17. Posicione a pipeta perto da membrana. Aterrisse firmemente no centro da célula.
       nota: Ao pousar, ocorrerá uma pequena covinha na superfície do neurônio e uma duplicação/triplicação da resistência de entrada.
   18. Aplique pressão negativa (sucção) usando uma seringa ou pipeta bucal. Ligue o potencial de retenção de -60 mV. A resistência da vedação deve aumentar até passar por um giga-ohm.
       nota: Trabalhe rápido para reduzir o tempo entre o enchimento de um eletrodo e o pouso em uma célula. Há um tempo limitado antes que a anfotericina adicionada à solução interna do remendo perfurado atinja a ponta do eletrodo. Uma vez que a ponta está contaminada com anfotericina, é difícil formar vedações de alta resistência, e a resistência geralmente se estabiliza em ~ 200 megaohms.
   19. Assim que uma vedação de giga-ohm se formar, libere a pressão negativa. Assim que a vedação se formar, aplique a compensação de capacitância rápida para reduzir ao máximo a amplitude dos transientes de capacitância da pipeta no modo de teste de membrana.
   20. À medida que a anfotericina começa a funcionar, observe como a resistência de entrada diminui lentamente e a corrente que flui em resposta ao passo de tensão de 5 mV aumenta progressivamente à medida que a anfotericina entra na membrana. Uma diminuição repentina na resistência em série em vez de estabilização gradual sugere que ocorreu ruptura espontânea.
   21. Estime a capacitância de toda a célula e a resistência em série usando a função de anulação transitória capacitiva do amplificador. Documente e monitore a resistência em série no início e regularmente durante o experimento.
       nota: A resistência em série pode levar de 5 a 20 minutos para se estabilizar, dependendo do tamanho do eletrodo e da quantidade de solução limpa que é aspirada para a pipeta. Os modos de pinça de tensão e pinça de corrente podem ser usados quando a resistência em série se estabilizar abaixo de 30 megaohms. Às vezes, observa-se inchaço ou encolhimento dos neurônios durante o registro, mas raramente quando a osmolaridade e o pH das soluções são ajustados corretamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anfotericina	Sigma-Aldrich	Rolamento A4888-100MG	Para gravações de patch perfurado.
ATP dissódico	Sigma-Aldrich	Rolamento A7699	Aditivo para solução interna
CaCl2	J.T. Padeiro	1311-01	Aditivo para solução interna
Dmso	Biotium	Rolamento 90082
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Aditivo para solução interna
Extrator de eletrodo	Narashige	PC-10
etanol	Laboratórios Decon	2716	para a cabeça de limpeza e ao redor da bancada de dissecação
Capilares de borossilicato filamentado para eletrodos	Instrumentos Sutter	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	para tamponamento de pH todas as soluções no protocolo
Placa quente / agitadores magnéticos	VWR	Nº 76549-914
K2SO4, Sulfato de Potássio	Sigma Aldrich	Rolamento P9458-250G	Aditivo para solução interna
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 93333	Aditivo para solução interna
KOH (1 milhão)	Honeywell	319376-500ML	Para trazer a solução interna ao pH desejado.
Câmara de gravação de banho de baixo perfil para pratos de cultura	Warner Instruments	Telefone: 64-0236
MgCl 2-Hexahidrato	Sigma-Aldrich	M1028	Aditivo para solução interna
Agulha microFil para enchimento de micropipetas - calibre 34	Instrumentos de precisão mundiais	MF34G
Microforja	Narashige	MF-90	Para polimento de eletrodos.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Aditivo para solução interna
NaOH (1 m)	Thomas Científico	319511-500ML	para titulação de pH
Oxigênio, grau médico, com regulador e tubulação adequados	Gerenciamento de materiais da USC	MEDOX200 (Identificador: 00015)	para dissolução em soluções de dissecação e banho
Vidro revestido de poli-d-lisina com fundo prato de cultura	Mattek	P35GC-0-10-C	para colocar neurônios para cultura
Filtros de membrana PES, 0,2 micrômetros	Nalgene	Rolamento 566-0020	para soluções filtrantes
Filtros de seringa estéreis de membrana PES, 0,22 um, 30 mm	TRATAMENTO CELULAR	229747	para filtrar soluções aspiradas em seringas
Medidor de pH	Mettler Toledo	Modelo S20
Célula de referência	Instrumentos de precisão mundiais	RC1T
Escala Científica	Mettler Toledo	XS64
Balão volumétrico de 1000 ml
Água, estéril u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (por exemplo, filtrada por um sistema de purificação de água Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001