Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do eletrodo (Figura 1A-C)
NOTA: Os loci de pinos do computador são simplesmente um contato de ponta como parte da interface de sinal em dispositivos de comunicação. Consiste em um conector macho que se conecta ao conector fêmea.
- Separe cuidadosamente os pinos macho e fêmea dos pinos do computador (Figura 1A) com a ajuda de uma pinça. Conecte os pinos macho e fêmea para formar um eletrodo e aplique cianoacrilato para criar uma forte ligação adesiva (Figura 1C).
- Coloque os eletrodos em um béquer cheio de água destilada e coloque-o no limpador ultrassônico por 10 min. Mova-os para um forno de secagem a 45 ° C por 30 min. Esterilize os eletrodos usando luz ultravioleta (UV) por 30 min.
2. Procedimento cirúrgico (Figura 1D-F)
- Prepare os instrumentos cirúrgicos esterilizados e o aparelho estereotáxico. Anestesiar o filhote de rato neonatal usando anestesia com isoflurano (2,5%) com ar. Quando o filhote estiver profundamente anestesiado, ajuste a dose de isoflurano para 1,0%. Faça uma pinça da cauda ou do dedo do pé antes da cirurgia para garantir a profundidade adequada da anestesia.
- Fixe a cabeça do filhote no aparelho estereotáxico colocando as barras auriculares nos canais auditivos e apertando-as levemente.
nota: Não aperte excessivamente as barras auriculares, pois o crânio neonatal é muito macio.
- Mantenha o campo cirúrgico estéril pulverizando todos os equipamentos com etanol 70%. Faça uma incisão de 15 mm na cabeça usando um bisturi. Usando uma pinça, puxe suavemente o couro cabeludo para longe da linha média nos quatro cantos. Coloque um pouco de algodão embebido em solução salina abaixo da pele para manter a incisão bem aberta (Figura 1D).
- Encontre os pontos bregma e lambda no crânio e marque-os com um lápis. Use uma agulha de seringa (26 G) para fazer dois orifícios no córtex pré-frontal (CPF) e no hipocampo.
nota: O PFC está localizado a +1,8 mm posterior ao bregma e -0,5 mm lateral à linha média, enquanto o hipocampo está localizado a -2,0 mm anterior ao bregma e ±0,5 mm lateral à linha média (Figura 1D e E). A profundidade do eletrodo não deve ser superior a 2 mm abaixo da superfície cortical para minimizar os danos cerebrais.
- Use uma pinça para segurar os eletrodos e insira os eletrodos de referência e registro no PFC e no hipocampo, respectivamente. Aplique pomada de eritromicina ao redor do eletrodo para evitar qualquer possível infecção. Fixe o eletrodo usando cianoacrilato.
- Prepare o cimento acrílico dental para que tenha uma consistência pegajosa e viscosa. Aplique o cimento dentário para cobrir os eletrodos e o restante do crânio.
nota: Seque bem o crânio antes de aplicar o cimento dentário.
- Aplique ácido pícrico a 5% nos eletrodos para protegê-los.
nota: Todo o procedimento deve ser feito em uma capa de biossegurança para manter as condições estéreis.
- Retirar o animal da estrutura estereotáxica e injetar 300 μL de glicose a 10% por via subcutânea. Coloque-o em um cobertor aquecido para recuperação. Certifique-se de que o animal esteja quente (37 °C) e ambulatorial (ou seja, completamente recuperado). Administrar buprenorfina por via intraperitoneal (0,05 mg/kg) para dor pós-cirúrgica.
nota: Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente (ou seja, comportamento e movimento normais).
- Devolva o filhote à sua gaiola de origem com sua mãe depois que ele recuperar a consciência. Aguarde dois dias até que o animal esteja totalmente recuperado.
3. Gravação de EEG
- Após a recuperação completa, conecte os eletrodos implantados no crânio do filhote ao amplificador em sua própria gaiola. Conecte o amplifier a um conversor analógico-digital e conecte o conversor a um computador; As linhas de conexão devem ser tratadas com cuidado para que não fiquem emaranhadas.
- Selecione pelo menos 10,000 Hz samptaxa na unidade de aquisição de dados para gravação (a largura de banda do transmissor é de 1-100 Hz). Certifique-se de que os dados sejam amostrados corretamente.
- Depois de obter o registro inicial, injete o filhote por via intraperitoneal com ácido caínico (KA, 2 mg/kg) para induzir crises epilépticas. 15 min após a injeção de KA, observe e registre as descargas epilépticas. As convulsões produzidas por meio de KA são geralmente físicas.
NOTA: A duração ictal-tônica é de cerca de 15,2 ±0,9 s, a duração da convulsão é de cerca de 62±5 s. As convulsões podem ser evitadas no rato neonatal administrando injeção IP de hidrato de cloral (400 mg / kg).
- Salve os dados digitalizados e analise-os usando pacotes de software de processamento de sinal, como spike2. Revele o nível de potência de diferentes componentes de frequência no sinal de EEG neonatal realizando uma análise do espectro de potência. Calcule a potência em um período de tempo de 1 minuto encontrando a amplitude quadrática média de 1 a 100 Hz (banda EEG).
