Registro de grampo de patch emparelhado das conexões neuronais em fatias cerebrais agudas

Resumo

Fonte: Qi, G., et al. Caracterização eletrofisiológica e morfológica de microcircuitos neuronais em fatias cerebrais agudas usando gravações de patch-clamp emparelhadas. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o procedimento para mapear conexões sinápticas protegendo uma fatia de cérebro, posicionando pipetas para obter configurações de células inteiras e estimulando neurônios pré-sinápticos a registrar respostas pós-sinápticas, elucidando assim a conectividade neuronal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Gravação de Patch-Clamp Emparelhado e Preenchimento de Biocitina

Dependendo do tipo de conexão sináptica, três abordagens diferentes são usadas para encontrar neurônios sinapticamente acoplados. Se a probabilidade de conexão for baixa (como pode ser esperado para a maioria das conexões excitatórias), proceda da seguinte forma:

1. Conexões neuronais com baixa conectividade
   1. Encha as pipetas de remendo com uma solução interna da composição listada na Tabela 1. Para todos os registros na configuração de células inteiras, adicione biocitina em concentrações entre 3 - 5 mg / ml à solução interna (pipeta) para obter bons resultados de coloração para os neurônios pré e pós-sinápticos. Deixe a biocitina se difundir na célula por pelo menos 15 a 30 minutos (dependendo do tamanho do neurônio).
      NOTA: Não adicione biocitina à solução usada nas pipetas de 'pesquisa' mencionadas abaixo.
   2. Patch um suposto neurônio pós-sináptico no modo de célula inteira. Use pipetas de remendo com haste longa e fina. Isso facilita a manobrabilidade da pipeta sob a objetiva e reduz os artefatos de movimento que podem ocorrer quando o eletrodo é introduzido na fatia.
   3. Em seguida, remende um neurônio pré-sináptico em potencial em uma configuração ligada à célula usando uma pipeta de remendo de 'busca' de resistência de 8 a 10 MΩ e um pequeno diâmetro de ponta. Essas pipetas estabelecem um adesivo "solto" ligado à célula. Encha a pipeta de 'pesquisa' com uma solução interna na qual K⁺ é substituído por Na⁺ (Tabela 2) para evitar que os neurônios se despolarizem durante a busca por uma célula pré-sináptica.
      NOTA: A resistência da vedação 'solta' não está na faixa GΩ, mas normalmente em torno de 30 - 300 MΩ.
   4. Mantenha o potencial de membrana sob a vedação 'solta' em cerca de -30 a -60 mV no modo de grampo de corrente. Em seguida, aplique grandes pulsos de corrente (0,2 - 2 nA) para provocar um potencial de ação na célula pré-sináptica potencial. Observe esse potencial de ação como uma pequena espigueta na resposta de tensão.
   5. Defina a frequência de estimulação para 0,1 Hz para evitar o esgotamento de uma resposta pós-sináptica. Use frequências de estimulação mais baixas se o tecido cerebral for muito imaturo ou a conexão sináptica não for muito confiável.
   6. Caso o neurônio 'pós-sináptico' não responda à estimulação do neurônio 'pré-sináptico' testado, remende um novo neurônio no modo de vedação 'solto'. Não substitua o eletrodo de remendo de 'busca' desde que a vedação com uma resistência de >30 MΩ esteja estabelecida. Dessa forma, teste até 30 neurônios potencialmente pré-sinápticos.
      nota: Para evitar danificar o neurônio durante o procedimento de busca com um patch clamp solto, apenas uma sucção suave deve ser aplicada à pipeta de busca em comparação com a aplicada à pipeta de adesivo de célula inteira.
   7. Se a estimulação no modo de vedação 'frouxo' resultar em um EPSP / IPSP (potencial pós-sináptico excitatório / potencial pós-sináptico inibitório) com uma latência <5 ms no neurônio pós-sináptico, remova a pipeta de 'busca' do neurônio pré-sináptico.
   8. Substitua a pipeta de adesivo de 'busca' por um eletrodo de adesivo cheio de solução interna regular contendo biocitina. Certifique-se de que esta pipeta de registro tenha uma resistência de 4 a 8 MΩ; Quanto maior o tamanho do soma, menor pode ser a resistência do eletrodo.
   9. Corrija o neurônio pré-sináptico e registre no modo de pinça de corrente de célula inteira. Elimine potenciais de ação por injeção de corrente nos neurônios pré-sinápticos e registre a resposta pós-sináptica. Armazene os dados em um computador para posterior análise offline.

Tabela 1. Solução de pipeta com baixo teor de cloreto.

	milímetro	g/L	g/50 ml
K-gluconato	135	31.622	1,5811
Kcl	4	0,298	0,0149
HEPES	10	2.384	0,1192
Fosfocreatina	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-Na	0,3	0,156	0,0078
Ajuste o pH para 7,3 com KOH
Osmolaridade ~300 mOsmol/L
Adicione 3 - 5 mg/ml de biocitina

Tabela 2. Solução de pipeta de alta sêmia para busca de neurônios sinapticamente acoplados.

	milímetro	g/L	g/50 ml
Na-gluconato	105	22.92	1.146
NaCl	30	1,76	0,088
HEPES	10	2.384	0,1192
Fosfocreatina	10	2.552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0,1014
GTP-Na	0,3	0,156	0,0078
Ajuste o pH para 7,3 com NaOH
Osmolaridade ~300 mOsmol/L

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
amplificador	HEKA	EPC 10 USB Triplo	com 2-3 pré-amplificadores
microscópio	Olimpo	BX51WI	com 2 portas de câmera e uma objetiva de 4×, uma objetiva de imersão em água de 40×
câmera	Fotônica TILL	VX55	câmera CCD infravermelha
workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	Com uma platina XY motorizada e um eixo de foco motorizado para o microscópio
Micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5	Manipuladores XYZ para 2-3 pré-amplificadores
Gaiola de Faraday	Luigs & Neumann
Mesa antivibração	Espectros de Newport-Física
Mestre de Retalhos	HEKA
Micrótomo	Microm Internacional	HM650V
Extrator de micropipetas	HEKA	Sutter P-97
Sistema Neurolúcida	Microcampo claro		com os softwares Neurolucida e Neuroexplorer