Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Gravações de grampo de patch
- Coloque a solução do eletrodo (consulte a Tabela 1) no gelo para evitar a degradação. Encha a pipeta de vidro com solução intracelular filtrada (filtro de seringa, tamanho do poro: 0,2 μm) e coloque a pipeta no suporte da pipeta do estágio principal. Aplique uma pressão suave e positiva na pipeta através de uma seringa de 5 ml, deslocando o êmbolo cerca de 1 ml antes de abaixar a pipeta na solução do banho.
Nota: Isso evita que a pipeta fique bloqueada.
- Escolha o modo "V-clamp" girando o botão de modo no amplifier e, em seguida, abra a interface "Teste de membrana" no software. Mova a pipeta para perto do neurônio alvo sob inspeção microscópica.
nota: Na preparação intacta do DRG, uma fina camada de células gliais satélites encapsula cada neurônio.
- Use pressão positiva da pipeta para atravessar a camada de células gliais satélites até que um aumento repentino do espaço entre o neurônio e a camada circundante de células gliais satélites seja observado. Continue movendo a pipeta em direção ao neurônio até que uma "covinha" seja observada no neurônio.
nota: Em comparação com as gravações de neurônios dissociados, a pressão positiva precisa ser um pouco maior, o que ajudará a penetrar na camada de células gliais satélites e aumentar as chances de correção bem-sucedida.
- Reduza a pressão positiva. Em seguida, obtenha uma vedação de giga ohm com sucção suave.
nota: Com este método, a taxa de sucesso de gravação é de pelo menos 70%.
- Obtenha a configuração de gravação de célula inteira conforme descrito anteriormente.
- Penetre brevemente na membrana celular do neurônio por meio de uma sucção curta, mas forte. Como alternativa, use a função "zap" do amplificador enquanto a sucção é aplicada.
- Uma vez que um modo de célula inteira é estabelecido, compense a capacitância da célula inteira e a resistência em série (Rs) girando os botões de compensação de capacitância e resistência no amplificador.
nota: Rs é normalmente 5-20 MΩ.
- Abandone a célula se Rs for inicialmente maior que 30 MΩ ou mudar em mais de 20% durante a gravação. Além disso, meça o potencial de membrana em repouso; abandonar uma célula se for superior a -50 mV.
- Feche a janela "Teste de membrana". Escolha o modo "I-clamp normal" girando o botão de modo no amplificador.
- Clique em "abrir protocolo" no software, selecione e carregue o protocolo para medir a reobase. Clique em "gravar" para iniciar a gravação. Meça a resistência de entrada e a reobase para examinar a excitabilidade neuronal injetando uma série graduada de correntes despolarizantes em etapas de 100 pA.
- Clique em "abrir protocolo" no software, selecione e carregue o protocolo para medir a reobase. Clique em "gravar" para iniciar a gravação. Meça a resistência de entrada e a reobase para examinar a excitabilidade neuronal injetando uma série graduada de correntes despolarizantes em etapas de 100 pA.
- Use um software de aquisição e análise de dados (por exemplo, Clampfit) para analisar os traços registrados de acordo com as instruções do fabricante. O software calcula a resistência de entrada (Rin) com base na relação IV em estado estacionário durante as correntes hiperpolarizantes fornecidas. Mova o cursor para medir o valor da reobase e do limiar da membrana. nota: A amplitude da corrente necessária para induzir o AP é definida como a reobase, e a tensão mais baixa para induzir o AP é definida como o limiar da membrana.
- Registre as correntes induzidas pelo ligante.
- Encha uma pipeta com os agonistas específicos.
Nota: No presente relatório, usamos 100 μM de glutamato e 100 μM de AITC para induzir as correntes mediadas pelos receptores de glutamato e receptores TRPA1, respectivamente.
- Verifique a pipeta para se certificar de que não há bolhas de ar dentro. Coloque a pipeta no suporte da pipeta. Conecte o porta-pipetas com um tubo conectado a um sistema de distribuição de medicamentos.
- Use o manipulador para mover a pipeta dentro de 50 μm do neurônio. Defina a pressão do sistema de distribuição de medicamentos para 1 psi e a duração para 1 seg. Mude o modo de gravação para voltage clamp e clamp em -70 mV. Aplique brevemente a pressão através do sistema de distribuição de medicamentos para registrar uma corrente induzida por medicamentos.
Tabela 1
| 100 ml de solução intracelular |
| Concentração (mM) | componente | Mw | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | Kcl | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 | EGTA | | |
| algarismo | MgCl2*6H2O | 203,3 | |
| Notas: Ajuste o pH para 7,4 com KOH e a osmolaridade para 260 - 280 mOsm com sacarose e água destilada. Adicione 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2GTP e filtre antes do uso imediato. |
