Avaliação de sinapses de fita em regiões de frequência específicas da cóclea de camundongo

Resumo

Fonte: Yu, S., et al. Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específicas da cóclea de camundongo. (2019).

Este vídeo demonstra um método para avaliar sinapses de fita em regiões específicas da cóclea do camundongo. Ele utiliza técnicas de imunocoloração e imagem confocal para identificar sinapses funcionais em diferentes regiões de frequência em cada giro coclear.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem o manuseio de animais foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Seleção de animais

1. Para todos os experimentos, use camundongos machos C57BL / 6J adultos (8 semanas de idade) como modelo animal.
   NOTA: Camundongos C57BL / 6J portadores de uma variante de splice do Cdh23 exibem senescência acelerada no sistema auditivo, refletida como uma perda de 40% das sinapses de fita na volta basal da cóclea e uma perda de 10% na volta média aos 6 meses de idade, seguida por um rápido aumento dessa perda em toda a cóclea com a idade. Assim, aconselhamos cautela ao usar camundongos C57BL/6J com mais de 6 meses para pesquisa auditiva. Outras linhagens de camundongos podem ser usadas dependendo de objetivos experimentais específicos.
2. Inspecione os camundongos usando um otoscópio de bolso de diagnóstico profissional para descartar patologias do ouvido externo ou médio antes das avaliações auditivas. Os sinais potenciais podem incluir líquido ou pus no conduto auditivo externo, vermelhidão e edema no tecido local e perfuração da membrana timpânica.
   NOTA: Embora isso raramente seja encontrado, uma vez identificado, camundongos com doenças do ouvido externo ou médio devem ser excluídos.

2. Avaliação auditiva

1. Anestesiar camundongos usando uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg) e cloridrato de xilazina (10 mg / kg). Avaliar a profundidade da anestesia por meio de estímulos dolorosos (por exemplo, reflexo de pinça do dedo do pé).
   NOTA: Quando o reflexo de pinça do dedo do pé está completamente ausente, o animal atingiu uma profundidade adequada de anestesia para o teste auditivo. Se for necessário mais tempo para registros bilaterais de ABR (resposta auditiva do tronco encefálico), administre uma dose mais baixa (um quinto da dosagem original) de anestésicos para restaurar o plano anestésico original. Tome cuidado para evitar overdose de anestésicos, pois isso pode levar à morte em camundongos.
2. Mantenha a temperatura corporal do animal anestesiado a 37,5 °C usando uma almofada térmica termorreguladora. Colocar o animal anestesiado em uma sala blindada elétrica e acusticamente para evitar interferências durante todo o teste auditivo.
   NOTA: Manter a temperatura fisiológica durante todo o procedimento até que o animal esteja totalmente acordado para evitar a morte causada por hipotermia pós-anestésica.
3. Coloque eletrodos de agulha subdérmicos (20 mm, 28 G) no vértice do crânio (eletrodo de registro), na região parótida ipsilateral abaixo do pavilhão auricular da orelha medida (eletrodo de referência) e na região parotídea contralateral (eletrodo terra), com uma profundidade de 3 mm sob a pele da cabeça do camundongo, respectivamente.
4. Use um alto-falante de campo fechado para realizar a estimulação acústica por meio de um tubo de plástico de 2 cm com uma ponta em forma de cone. Encaixe a ponta no canal auditivo externo.
   NOTA: Certifique-se de que a impedância elétrica nos eletrodos de gravação e referência seja inferior a 3 kOhm (geralmente 1 kOhm). Se a impedância for alta, mude o local de inserção do eletrodo, limpe o eletrodo com álcool ou substitua o eletrodo para evitar alterações na amplitude da onda ABR.
5. Para gravação ABR, gere pips de tom (duração de 3 ms, tempos de subida/descida de 1 ms, a uma taxa de 21.1/s, frequência: 4–48 kHz) e apresente-os em níveis decrescentes de pressão sonora (SPLs) de 90 a 10 dB em passos de SPL de 5\u201210 dB. Durante esta etapa, as respostas são amplificadas (10.000 vezes), filtradas (0,1–3 kHz) e calculadas a média (1.024 amostras/nível de estímulo).
   NOTA: Os ABRs são coletados para cada nível de estímulo em passos de 10 dB, com passos adicionais de 5 dB próximos ao limite.
6. Em cada frequência, determine o limiar do PEATE, que se refere ao NPS mínimo, resultando em um registro confiável do PEATE com uma ou mais ondas distinguíveis que podem ser claramente identificadas por inspeção visual.
   NOTA: Geralmente é necessário repetir o processo para SPLs baixos em torno do limite para garantir a consistência das formas de onda. O limiar de resposta é o nível de estímulo mais baixo no qual a forma de onda pode ser observada quando uma diminuição de 5 dB levaria ao desaparecimento da forma de onda.

3. Processamento de tecido coclear

1. Após o registro do PEATE, eutanasiar os camundongos anestesiados por luxação cervical, decapitá-los, expor a bula do lado ventral e abri-los com uma tesoura afiada para ter acesso à cóclea.
2. Usando uma pinça fina, remova os ossos temporais, corte a artéria do estribo, remova o estribo da janela oval e rompa a membrana da janela redonda. Faça um pequeno orifício no ápice da cóclea girando suavemente a ponta de uma agulha (13 mm, 27 G).
3. Fixe os ossos isolados com paraformaldeído a 4% (peso / vol) em solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) durante a noite a 4 ° C. Usando uma pipeta de ponta fina, lave suavemente o fixador através dos espaços perilinfáticos por meio da aplicação nas janelas ovais ou redondas (como uma entrada) e na abertura no ápice (como uma saída).
   NOTA: Algumas proteínas requerem uma curta duração de fixação para evitar a destruição de seus epítopos para imunomarcação. Nesses casos, incubar os ossos em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente (RT) por 2 h, dependendo das instruções do fabricante para imuno-histoquímica. A fixação também pode ser realizada por meio de perfusão cardíaca para remover o sangue coclear, evitando ruído de fundo devido à coloração inespecífica em estágios posteriores, particularmente em modelos de camundongos com sinaptopatia coclear.
4. Enxágue os ossos três vezes por 5 min com PBS frio 0,1 M para remover o paraformaldeído residual. Descalcificar os ossos com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% em RT durante 4 h ou a 4 °C durante 24 h por meio de agitação suave num agitador horizontal a 20 rpm. O EDTA pode ser atualizado no meio do caminho.
   NOTA: Os tempos de descalcificação estão sujeitos à concentração de EDTA e às preferências dos usuários. O tecido descalcificado deve manter um certo grau de tenacidade, o que facilita a manipulação do isolamento de montagens cocleares inteiras em etapas posteriores. Os ossos temporais podem ser descalcificados em EDTA a 10% com rotação, permitindo que os pesquisadores deixem o laboratório após testes de ABR e experimentos de fixação. O tempo de descalcificação é flexível na faixa de 20 a 30 h a 4 °C.
5. Transfira um osso temporal descalcificado de EDTA para 0,1 M PBS. Use as pinças Dumont # 3 e # 5 e a agulha 27 G para dissecar as regiões cocleares apical, média e basal e, em seguida, dissecar a cóclea para fora do osso sob um microscópio de dissecção estéreo. Faça uma série de pequenos cortes ao longo do ligamento espiral usando uma lâmina de barbear e remova a membrana tectória e a membrana de Reissner (Figura 1).
   NOTA: Desde que a cóclea dissecada esteja intacta, este processo pode ser modificado de acordo com o protocolo usual do operador individual.
6. Disseque ainda mais o epitélio auditivo restante, incluindo o limbo espiral, em voltas cocleares individuais (ápice, meio e base com região de gancho) para preparações de montagem inteira.
7. Sob uma objetiva de óleo de 40x de um microscópio óptico, meça o comprimento da membrana basilar com uma escala de 250 μm colocada na ocular, que pode ser ajustada ao longo dos estereocílios dos IHCs.
8. Calcule o comprimento de cada volta coclear somando todos os comprimentos de segmento (250 μm por segmento) e, concomitantemente, obtenha o comprimento total da membrana basilar somando os comprimentos de cada volta.
9. Converta o comprimento total da membrana basilar, incluindo a região do gancho, em uma porcentagem com base na distância do ápice coclear (0% refere-se ao ápice coclear, 100% à base coclear).
10. Converta essa distância na frequência característica da cóclea usando uma função logarítmica (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), com uma inclinação de 1,25 mm/oitava de frequência, onde d é a distância normalizada do ápice coclear em porcentagem, f é a frequência em kHz), conforme descrito anteriormente. Assim, a faixa de frequência em uma área correspondente da membrana basilar em cada giro coclear pode ser adquirida.

4. Coloração por imunofluorescência

1. Após a dissecção, coloque cada volta coclear em um tubo de centrífuga separado de 2,5 mL e incube as voltas cocleares em soro de cabra a 10% / PBS / Triton X-100 a 0,1% por 1 h em RT em um rotador.
2. Remova a solução de bloqueio/permeabilização acima de cada tubo usando uma ponta de pipeta de 200 μL sob um microscópio de dissecção e incube as amostras com anticorpos primários diluídos em soro de cabra a 5% / PBS / Triton X-100 a 0,1% durante a noite a 4 ° C em um rotador.
   NOTA: Para imunomarcação de fitas sinápticas cocleares, use o marcador pré-sináptico de camundongo anti-carboxi-terminal de ligação 2 IgG1 (CtBP2, marcando o domínio B da proteína de andaime RIBEYE, 1:400) e o marcador pós-sináptico de camundongo anti-receptor de glutamato 2 IgG2a (GluR2, marcando uma subunidade do ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico ou receptor AMPA, 1:200).
3. Enxágue três vezes por 5 min com PBS frio 0,1 M para remover anticorpos primários residuais e incube as amostras com anticorpos secundários diluídos em soro de cabra a 5% / PBS / Triton X-100 a 0,1% em RT por 2 a 3 h no escuro em um rotador.
   NOTA: Prepare misturas de anticorpos secundários apropriadas usando Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) e Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500) anti-camundongo de cabra, que são complementares aos anticorpos primários usados na etapa 4.2. Para melhorar a eficiência da marcação de fitas sinápticas, recomendamos a seleção de anticorpos secundários específicos. Alguns laboratórios estendem a incubação com anticorpos secundários para aumentar a imunomarcação de GluR2.
4. Enxágue três vezes por 5 min com 0,1 M PBS para remover anticorpos secundários residuais e transfira as amostras de tubos de centrífuga de 2,5 mL para placas de 35 mm contendo 0,1 M PBS.
5. Coloque uma gota de meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) na lâmina e transfira as amostras do PBS para o meio de montagem. Coloque uma borda de uma lamínula no slide e solte para que a lamínula caia suavemente.
   NOTA: Para garantir que as células ciliadas estejam voltadas para cima e que não ocorra dobra ou torção das amostras cocleares durante o procedimento, monte as amostras cocleares sob um microscópio de dissecção estéreo.
6. Coloque as lâminas em uma caixa de lâminas a 4 ° C durante a noite para deixar as lâminas secarem e, em seguida, obtenha imagens sob um microscópio confocal a laser.

5. Avaliação morfológica das sinapses de fita coclear

1. A imagem é exibida usando um microscópio confocal com três lasers - um diodo UV de 405 nm, um laser de argônio de 488 nm e um laser de estado sólido bombeado por diodo (DPSS) de 561 nm para excitar DAPI (espectro de excitação 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (espectro de excitação 496–549 nm) e Alexa Fluor 568 (espectro de excitação 573–631 nm), respectivamente.
2. Adquira pilhas z confocais a uma distância de 8 μm de cada volta coclear usando uma lente de imersão em óleo de alta resolução de 63x.
   NOTA: Uma vez definidos, todos os parâmetros para digitalização de fotomicrografias devem ser salvos e aplicados uniformemente a todas as lâminas.
3. Para contagens de pontos sinápticos, defina as pilhas z (tamanho do passo de 0,3 μm) para abranger todo o comprimento das células ciliadas internas (IHCs), garantindo assim que todos os pontos sinápticos possam ser visualizados.
4. Mescle as imagens que contêm pontos em uma pilha z para obter a projeção do eixo z e importe para o software de processamento de imagem.
5. Divida as contagens totais sinápticas em cada pilha z em regiões de frequência específicas pelo número de IHCs (igual às contagens manuais nucleares DAPI) para calcular o número de pontos sinápticos para cada IHC. Em cada região de frequência específica, calcule a média de todos os pontos sinápticos em três imagens de diferentes campos microscópicos contendo 9 a 11 IHCs.
   1. Descreva a região de interesse (ROIs), incluindo as regiões basolaterais de cada IHC, usando o botão de seleções à mão livre. Use a função de medição para quantificação automática de pontos e a função de bacia hidrográfica para distinguir entre pontos adjacentes.
   2. Após cada contagem automatizada, realize inspeções visuais com correções manuais para garantir que a contagem de pontos seja confiável.
      NOTA: Os experimentadores devem permanecer cegos quanto ao fato de a lâmina ser do ápice, do meio ou da volta basal da cóclea.
6. Avalie visualmente a estrutura e distribuição sináptica para isolar manualmente IHCs individuais de seus vizinhos pela Pencil Tool (M) para visualizar melhor a arquitetura do citoesqueleto e a localização sináptica.
7. Para inspecionar a justaposição de fitas pré-sinápticas (CtBP2) e manchas de receptores pós-sinápticos (GluR2), extraia o espaço de voxel ao redor da fita com a Rectangular Marquee Tool e isole a fita individual por Crop. Ao clicar em Imagem > Tamanho da Imagem, adquira uma matriz de miniaturas dessas projeções em miniatura, que podem ser usadas para identificar sinapses emparelhadas (apareceram como pares justapostos de pontos CtBP2-positivos e GluR2-positivos) versus fitas órfãs (sem placas receptoras de glutamato pós-sinápticas) (Figura 2).
   NOTA: As sinapses cocleares normais aparecem como imunomarcação combinada da fita pré-sináptica dentro da célula ciliada (anti-CtBP2) e do adesivo receptor de glutamato pós-sináptico no terminal do nervo auditivo (anti-GluR2). Alguns laboratórios usam projeções confocais em conjunto com modelagem 3D para quantificar o tamanho ou o volume do patch sináptico. Antes da perda significativa de sinapses de fita, fitas exibindo mudanças de tamanho ou sem placas de receptor de glutamato pareadas são provavelmente indicativas de disfunção sináptica.

Resultados

Figura 1: Localização da frequência coclear em camundongos. (A) Uma imagem representativa da cóclea explantada completa, que foi dissecada do osso temporal sob um microscópio de dissecção estéreo. (B) A cóclea do camundongo é dividida em espiras apicais, médias e basais, onde a parede lateral da cóclea é removida. Círculos vermelhos nos fragmentos da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de cetamina	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Cloridrato de xilazina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	X-1251	10 mg/kg
Aparelho de fisiologia TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Flórida, EUA	Sistema de Fisiologia Auditiva III
Software SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Flórida, EUA	Sistema de Fisiologia Auditiva III
Almofada Elétrica	Diversão com animais de estimação	11072931136
Fórceps Dumont 3#	Ferramentas de Belas Ciências, North Vancouver, BC, Canadá	0203-3-PO
Pinça Dumont 5#	Ferramentas de Belas Ciências, North Vancouver, BC, Canadá	0209-5-PO
Microscópio de dissecção estéreo	Nikon Corp., Tóquio, Japão	SMZ1270
Soro de cabra	ZSGB-BIO, Pequim, China	ZLI-9021
Receptor anti-glutamato 2 extracelular, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, EUA	MAB397	rato
Rato purificado Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, EUA	612044	rato
Alexa Fluor 568 cabra anti-rato IgG1anticorpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA	A21124	cabra
Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG2a anticorpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA	A21131	cabra
Meio de montagem contendo DAPI	ZSGB-BIO, Pequim, China	ZLI-9557
Microscopia fluorescente confocal	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha	TCS SP8 II
Software Image Pro Plus	Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA	Versão 6.0
Otoscópio de bolso de diagnóstico profissional	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Xangai, China	HS-OT10
Eletrodo de agulha	Amizade Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, China	1029	20 mm, 28 g
Alto-falante de campo fechado	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Flórida, EUA	CF1