Avaliação das interações entre neurônios glutamatérgicos e células de glioma em co-cultura

Resumo

Fonte: Fuchs, Q. et. al., Co-cultura de neurônios glutamatérgicos e células pediátricas de glioma de alto grau em dispositivos microfluídicos para avaliar interações elétricas. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a avaliação da atividade elétrica neuronal em uma co-cultura de neurônios glutamatérgicos corticais derivados de hiPSC e células de glioma usando um dispositivo microfluídico com matrizes de multieletrodos.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Protocolo de co-cultura

1. Ajustar o dia de semeadura e a concentração para as linhagens celulares UW479 e BT35 para atingir 80% de células confluentes quando a co-cultura deve começar, correspondendo a 21 dias de cultura para neurônios glutamatérgicos.
2. Tripsinize as células UW479 e BT35 e semeie-as no topo dos neurônios glutamatérgicos em cada dispositivo microfluídico dedicado (com uma densidade alvo de 900 células / mm² para cada tipo de célula) antes de semear as células de gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) no dispositivo microfluídico contendo neurônios glutamatérgicos maduros.
3. Mantenha as co-culturas por 2 dias em ambiente controlado (37 ° C, 5% CO₂) com neurônio glutamatérgico Day11 e meio posterior detalhado na Tabela 1.
4. Conte as células pHGG usando as imagens microscópicas analisadas com software de análise de imagem para avaliar sua viabilidade. Calcule a porcentagem de células.
   NOTA: Use a seguinte fórmula: 100 - ((número de células em D23 / número de células em D21) x 100).

2. Registro eletrofisiológico

1. Realizar o registro eletrofisiológico com sistema comercial e software disponível comercialmente.
   nota: Os experimentos foram realizados com um arranjo de múltiplos eletrodos (MEA) que consistiu em eletrodos de 30 μm de diâmetro espaçados por 100 μm.
2. Realize um primeiro registro eletrofisiológico em neurônios glutamatérgicos em D21 antes da semeadura de células pHGG. Use os neurônios glutamatérgicos diferenciados como controle e cultive-os sozinhos em paralelo à co-cultura. Faça uma segunda gravação para ambas as condições, conforme descrito na próxima etapa numerada 3.
3. Realize um segundo registro eletrofisiológico no D23 (após 2 dias de co-cultura).

Tabela 1: Composição de meios de cultura para neurônios glutamatérgicos derivados de hiPS.

Componentes	Meio de semeadura	D4 médio	D7 médio	D11 e meio em diante
DMEM/F-12 Médio	0,5x	0,25x	0,125x	Ø
Meio Neurobasal	0,5x	0,25x	0,125x	Ø
BrainPhys Médio	Ø	0,5x	0,75x	1x
Suplemento SM1	1x	1x	1x	1x
Suplemento N2-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM
BDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
Suplemento de semeadura	1x	Ø	Ø	Ø
Suplemento do Dia 4	Ø	1x	Ø	Ø

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
256MEA100/30iR-ITO-w/o	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-w/o
Sonda de 40 μm para contador de cetro	Dutscher	Rolamento 53750
Sonda de 60 μm para contador de cetro	Dutscher	Rolamento 51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	sigma	G8541
Gabinete de Segurança Biológica Classe II	Thermo Científico	HERASafe tipo KS12
Neurônios Glutamatérgicos Corticais	BrainXell	BX-0300
Meio DMEM/F12	sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
Frascos de cultura de células EasYFlaskTM 75cm3	Nunc	156499
Soro fetal bovino (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Tecnologias da Vida	A1413201
BDNF humano	Peprotech	450-02
incubadora	Memmert	IC0150med
MEA2100	Mcs	181205-MEA2100-11240
Micropipeta P10	Sartorius	LH-729020
Micropipeta P100	Sartorius	LH-729050
Micropipeta P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipeta P200	Sartorius	LH-729060
Microtubo Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
Experimentador Multicanal	Mcs	-
Suplemento N2-A	Célula-tronco	Nº 7152
Meio Neurobasal	Tecnologias da Vida	21103049
Suplemento neuronal Neurocult SM1	Célula-tronco	Rolamento 5711
Aminoácidos não essenciais (NEAA) sem L-glutamina	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipeta para cultura de células 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipeta para cultura de células 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Placa de motorista (CultureTemp)	Belarte	370151000
Poli-D-Lisina	sigma	Pág. 6407
Microscópio primovert	Zeiss	Rolamento 415510-1100-000