Implantando um feixe de eletrodos e fibra óptica no hipocampo do camundongo

Abstract

Fonte: Bender, F., et. al., Arrastamento optogenético de oscilações do hipocampo em camundongos que se comportam. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a implantação estereotáxica de um feixe de eletrodos de fio e uma fibra óptica no hipocampo de um modelo de camundongo.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de Fibras Ópticas (Figura 1A)

1. Use fibra óptica multimodo (núcleo de 105 μm, revestido de vidro com núcleo de sílica, 0,22 NA). Descasque o revestimento de 125 μm do núcleo da fibra usando um micro-stripper enquanto a fibra ainda está presa ao carretel de fibra.
2. Corte a fibra em um comprimento de aproximadamente 2-3 cm usando uma faca de diamante.
3. Insira a fibra em uma ponteira de cerâmica de zircônia (ID: 126 μm). Aproximadamente 0,5-1 mm da fibra óptica deve se projetar do lado convexo da ponteira.
4. Usando uma agulha, aplique uma gota de cola epóxi em ambas as extremidades da ponteira, mas não nas laterais da ponteira. Como alternativa, use super cola.
5. Deixe a cola secar por pelo menos 30 min.
6. Polir o lado convexo da ponteira usando filme de polimento de fibra de diamante (grãos de 3 μm).
7. Teste a fidelidade da transferência de luz usando um medidor de potência óptica.
   1. Defina o comprimento de onda no medidor de potência para o mesmo comprimento de onda do laser que está sendo usado.
   2. Posicione o patch cord com a ponta voltada para o centro do sensor. Ligue o laser e leia a saída de luz do medidor de energia. Registre o valor.
   3. Conecte a fibra óptica ao patch cord por meio de uma luva de acoplamento e posicione-a com a ponta da fibra voltada para o centro do sensor. Ligue o laser e leia a saída de luz do medidor de energia. Registre o valor.
   4. Calcule a taxa de transmissão dividindo o segundo valor pelo primeiro valor. Se a taxa de transmissão estiver abaixo de 0,5, descarte a fibra; caso contrário, use-o para implantação.
   5. Teste a taxa de transmissão de cada fibra antes da implantação.
   6. Para experimentos posteriores, ajuste a intensidade de luz do laser para a taxa de transmissão da fibra óptica: Defina a saída de luz da ponta do patch cord para 5-15 dividido pela taxa de transmissão para obter uma saída de luz final da ponta da fibra de 5-15 mW.

2. Preparação de matrizes de fios de tungstênio para gravações LFP (Figura 1B)

1. Cole várias guias de tubo de sílica de 100 μm (por exemplo, 6) em paralelo ao lado adesivo de um pedaço de fita. Corte uma peça, aproximadamente 4-6 mm, para um conjunto de matriz de fios.
2. Passe fios de tungstênio de 45 μm isolados com formvar através dos tubos-guia usando uma pinça.
3. Descasque seis fios de ligação de cobre fino isolados com esmalte (aproximadamente 5 mm de comprimento) e um fio de aterramento (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) usando um bisturi para raspar o isolamento em ambas as extremidades. Solde-os aos pinos do nanoconector.
4. Conecte cada fio de ligação a um fio de tungstênio usando uma gota de tinta condutora de prata, respectivamente. Deixe secar por pelo menos 30 min.
5. Aplique uma quantidade mínima de cimento para cobrir os fios. Não aplique cimento nos fios de tungstênio, que serão inseridos no tecido cerebral, ou na parte superior do nano conector. Deixe o cimento secar por pelo menos 30 minutos.
6. Execute um corte angular (5-20 °) dos fios de tungstênio usando uma tesoura de aço inoxidável romba para permitir a implantação confiável de fios abaixo ou acima da zona ventralmente adjacente ao estrato piramidal, onde a amplitude é muito baixa para estimar a fidelidade do arrastamento.
7. Isole a ponta (aproximadamente 2 mm) do fio terra usando um bisturi para raspar o isolamento. Trate-o com fluxo e pré-solda.
8. Verifique possíveis conversas cruzadas entre eletrodos usando um multímetro digital. Conecte os pinos do conector ao multímetro, que deve ser configurado para o modo de medição de resistência. Verifique as combinações de canais em pares; uma leitura no multímetro abaixo de 5 MΩ indica diafonia significativa.
9. Use um medidor de impedância para verificar a impedância de cada eletrodo de fio em solução salina. Os valores típicos de impedância estão abaixo de 100 kΩ.
10. Para facilitar a implantação, cole uma fibra óptica na matriz de fios para que a ponta da fibra fique no nível do fio mais curto e a ponta da fibra fique próxima, mas sem tocar nos fios de tungstênio. Mantenha o ângulo da fibra o menor possível para evitar danos aos tecidos durante a implantação.

3. Implantes estereotáxicos

1. Remova o tecido conjuntivo da parte superior do crânio e empurre completamente os músculos do pescoço em aproximadamente 2 mm para evitar artefatos musculares durante a gravação.
2. Limpar o crânio com aplicador de ponta de algodão e soro fisiológico e fazer quatro furos (2 na frente e dois acima do cerebelo, 0,8 mm de diâmetro) para colocação de parafusos ósseos de aço inoxidável (00-96x1/16) para aterramento e estabilização do implante (Figura 1D). Posicione o parafuso de aterramento, conectado a um fio de cobre (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) acima do cerebelo.
3. Cubra o parafuso de aterramento completamente com cimento para evitar artefatos musculares durante os registros eletrofisiológicos. Construa um anel de cimento conectando todos os parafusos (Figura 1E).
4. Realize uma craniotomia acima do lado da implantação (Hipocampo, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 em referência ao bregma). Aplique aproximadamente 5 μL de NaCl estéril na superfície do tecido cerebral.
5. Abaixe lentamente o feixe de fios usando estereotaxia na craniotomia. Para gravações unitárias, implante uma sonda de silicone em vez de uma matriz de fios. Para evitar artefatos de luz optoelétrica, implante a fibra óptica separadamente no hipocampo com a ponta da fibra não voltada diretamente para a sonda (Figura 1C-I). Para investigação da coordenação do arrastamento entre os hemisférios, implante uma fibra óptica adicional na área CA1 do hipocampo contralateral.
6. Para proteger o tecido cerebral, aplique aproximadamente 5 μL de cera líquida quente/óleo de parafina, pré-aquecido a 70 °C, com uma seringa acima do local de implantação.
7. Aplique cimento ao redor da matriz de arame e cubra o crânio com cimento.
8. Aplique uma gota de fluxo no fio terra/referência pré-soldado e no fio pré-soldado conectado ao parafuso de aterramento usando, por exemplo, uma agulha e funda os fios usando uma máquina de solda.
9. Cubra todo o fio terra com cimento.
10. Administre 0,3 mL de Erycinum (1:4 em NaCl estéril) e carprofeno (5mg/mL) i.p. após a cirurgia e por pelo menos os dois dias seguintes. O camundongo normalmente acorda dentro de 15 minutos após a cirurgia. Aqueça o animal com uma lâmpada vermelha para acelerar a recuperação.
11. Monitore o peso do camundongo diariamente durante a primeira semana após a cirurgia ou até que esteja estável. A perda de peso não deve exceder 10% do peso registrado do camundongo antes da cirurgia. Para acelerar a estabilização do peso, forneça ao camundongo ração úmida e leite condensado durante os primeiros dias após a cirurgia.
12. Para registrar a atividade celular do hipocampo durante o arrastamento, implante uma sonda de silicone no hipocampo (AP -1,94, L 1,4, V 1, com subsequente abaixamento) (Figura 1C - I). Implante a fibra óptica no hipocampo em AP -3, L 1,4, V 1,6, 39° caudal-rostral. Se a estimulação da somata celular for desejada, implante uma fibra óptica adicional no MS (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° lateral).

Results

Figura 1: Ilustração de fibras ópticas, eletrodos e cirurgia. (A) Ilustração de uma fibra óptica. (B) Ilustração de uma matriz de fios colada a uma fibra óptica para o registro do LFP do hipocampo durante o arrastamento das oscilações do hipocampo. (C) Para registrar a atividade celular do hipocampo, uma sonda de silicone é montada em um microdrive. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratos PV-Cre	O Laboratório Jackson	B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Estereotaxia	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA	Modelo 963	Instrumento estereotáxico para pequenos animais ultra preciso
Brocas, 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, Suíça	49080HM
Estação de solda	Weller Tools GmbH, Besigheim, Alemanha	WSD 81
eritromicina	Rotexmedica GmbH, Trittau, Alemanha	PZN: 10823932	1g de pó para solução para perfusão
Furadeira/esmerilhadeira de precisão	Proxxon, Wecker, Luxemburgo	FBS 240/E
Fibra óptica multimodo	ThorLabs, Dachau, Alemanha	FG105LCA	0,22 NA, Low-OH, Ø105 μm Core, 400 - 2400 nm
Virola de vara de cerâmica	Produtos de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUA	CFLC126	Virola de cerâmica LC MM, ID 126um
Papel de polimento	Thorlabs	LF3D	6 "x 6" Folha de Lapidação de Diamante (Polimento)
Medidor de energia	Thorlabs	PM100D	Console compacto do medidor do poder e da energia, 4" LCD de Digitas
Acoplador de fibra óptica multimodo	Thorlabs	FCMM50-50A-FC	Acoplador 1x2 MM, taxa de divisão 50:50, fibras GI de 50 μm, FC/PC
Cabo de remendo de fibra óptica	Thorlabs	FG105LCA CUSTOM-MUC	feito sob medida, 3 m de comprimento, com tubo de proteção, Tubo: FT030, Conector 1: FC/PC, Conector 2: 1,25 mm (LC) Virola de cerâmica
manga	Produtos de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUA	ADAL1	Luva de acoplamento dividida de cerâmica para ponteiras de Ø1,25 mm (LC/PC)
Fios de tungstênio	California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, EUA	CFW0010954	40 μm, 99,95%
Tubulação capilar	Optrônica	1068150020	Identificação: 100,4 μm
Nanoconector Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, EUA	A79038-001
Parafusos	Bilaney, Düsseldorf, Alemanha	00-96x1/16	em aço inoxidável
Tinta condutora de prata	Conrad electronics, Alemanha	530042
Fluxo líquido	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Alemanha	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)