Controle optogenético da dinâmica da rede hipocampal

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Controle optogenético no hipocampo isolado
   NOTA: Para o controle optogenético da atividade da rede hipocampal, uma estratégia específica do tipo de célula envolvendo a ativação rítmica de células GABAérgicas contendo PV (parvalbumina positiva) é usada aqui, pois essas células demonstraram desempenhar um papel importante na sincronização das principais populações de células no hipocampo isolado. A expressão seletiva da canalrodopsina-2 excitatória (ChR2) em células PV é alcançada cruzando a linha de camundongos PV-Cre com camundongos que expressam constitutivamente ChR2 Cre-dependente (Ai32), gerando assim camundongos PV-ChY. Alternativamente, construções de vetores virais (por exemplo, AAVdj-ChETA-eYFP) podem ser injetadas no hipocampo de camundongos PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) para conduzir a expressão da opsina excitatória em interneurônios CA1 / SUB ( Figura 1A ).
   1. Coloque um eletrodo LFP na área CA1 / SUB (Cornu ammonis-1 / subículo) e remende uma célula piramidal próxima no hipocampo isolado de um camundongo expressando a opsina excitatória sensível à luz azul ChR2 em interneurônios PV.
   2. Coloque uma guia de luz de fibra óptica (0,2 - 1 mm de diâmetro) acima da preparação do hipocampo e centralize-a na região registrada. Use luz azul (473 nm) de uma fonte de LED para estimulação optogenética, consistindo em pulsos de luz (10 - 20 ms, acionados por um sinal lógico de transistor-transistor) ou comandos de tensão de onda senoidal fornecidos em frequências (4 - 12 Hz).
   3. Mude para o grampo de corrente e caracterize a atividade do piramidal durante oscilações espontâneas.
   4. Inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Observe que as oscilações de campo e a atividade sináptica no neurônio registrado tornam-se cada vez mais sincronizadas durante a estimulação optogenética e que o ritmo rítmico das células PV resulta em um controle robusto da frequência e da potência das oscilações (Figura 1).

Figura 1: Potencial de campo local e gravações simultâneas de patch clamp de neurônios piramidais e PV CA1 / SUB únicos durante oscilações Theta espontâneas e optogenéticas no hipocampo isolado.

(a) Diagrama mostrando os locais de registro de LFP e eletrodo de patch com a colocação do guia de fibra de luz acima da região CA1/SUB expressando uma opsina sensível à luz azul (ChETA acoplado ao fluoróforo eYFP). (b) Caracterização de um neurônio piramidal mostrando propriedades típicas de Regular-Spiking (RS) (topo) e imagem de alta ampliação (40X) da célula registrada (abaixo). (c) Sample registro de pinça de corrente da mesma célula no potencial de membrana despolarizado (preto) junto com o sinal LFP (cinza) e mostrando IPSPs rítmicos sincronizados durante a oscilação espontânea (esquerda) e durante a estimulação luminosa de frequência (6 Hz) (direita). O padrão de estimulação da luz (sombreamento azul) é representado no topo dos traços de tensão. (d) Espectrograma e espectros de potência da forma de onda LFP antes, durante e após uma estimulação luminosa de 6 Hz (linha de base, estímulo, pós). (e) Imagens de campo claro e fluorescência de baixa ampliação da preparação isolada do hipocampo mostrando fluorescência eYFP (em verde) localizada na região CA1 / SUB. (f) Caracterização das etapas atuais mostrando o comportamento de Fast-Spiking (FS) de um interneurônio PV-TOM registrado (imagem de fluorescência 40X abaixo). (g) Registro do potencial de membrana mostrando grandes EPSPs e disparo rítmico da célula fotovoltaica registrada sincronizada com o sinal LFP durante a oscilação espontânea do campo (esquerda) e durante a estimulação luminosa (direita) a 3 Hz. (h) Média acionada por campo (FTA) de picos de células fotovoltaicas sobre o sinal CA1 / SUB LFP. A descarga da célula fotovoltaica em vários ensaios (centrados nos picos LFP) foi convertida em um FTA de picos registrados durante a oscilação espontânea (linha de base) e durante a estimulação luminosa (stim). Os gráficos do meio e do fundo mostram os gráficos raster de picos e histogramas de probabilidade de pico (a probabilidade média é mostrada em vermelho). Os gráficos superiores mostram gráficos do sinal LFP médio, que aumentou em potência durante a estimulação da luz em paralelo com o disparo altamente sincronizado da célula fotovoltaica bloqueada em fase para o pico da oscilação LFP.