Controle optogenético da dinâmica da rede hipocampal

Resumo

Fonte: Manseau, F., et al. Sintonia na Banda Theta do Hipocampo In Vitro: Metodologias para Gravação do Circuito Septo-Hipocampal de Roedores Isolados. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o método para usar a optogenética para modular a dinâmica da rede hipocampal, ativando interneurônios sensíveis à luz geneticamente modificados em uma fatia de cérebro de camundongo, aprimorando a sincronização da oscilação e estudando o comportamento do circuito neural.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Controle optogenético no hipocampo isolado
   NOTA: Para o controle optogenético da atividade da rede hipocampal, uma estratégia específica do tipo de célula envolvendo a ativação rítmica de células GABAérgicas contendo PV (parvalbumina positiva) é usada aqui, pois essas células demonstraram desempenhar um papel importante na sincronização das principais populações de células no hipocampo isolado. A expressão seletiva da canalrodopsina-2 excitatória (ChR2) em células PV é alcançada cruzando a linha de camundongos PV-Cre com camundongos que expressam constitutivamente ChR2 Cre-dependente (Ai32), gerando assim camundongos PV-ChY. Alternativamente, construções de vetores virais (por exemplo, AAVdj-ChETA-eYFP) podem ser injetadas no hipocampo de camundongos PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) para conduzir a expressão da opsina excitatória em interneurônios CA1 / SUB ( Figura 1A ).
   1. Coloque um eletrodo LFP na área CA1 / SUB (Cornu ammonis-1 / subículo) e remende uma célula piramidal próxima no hipocampo isolado de um camundongo expressando a opsina excitatória sensível à luz azul ChR2 em interneurônios PV.
   2. Coloque uma guia de luz de fibra óptica (0,2 - 1 mm de diâmetro) acima da preparação do hipocampo e centralize-a na região registrada. Use luz azul (473 nm) de uma fonte de LED para estimulação optogenética, consistindo em pulsos de luz (10 - 20 ms, acionados por um sinal lógico de transistor-transistor) ou comandos de tensão de onda senoidal fornecidos em frequências (4 - 12 Hz).
   3. Mude para o grampo de corrente e caracterize a atividade do piramidal durante oscilações espontâneas.
   4. Inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Observe que as oscilações de campo e a atividade sináptica no neurônio registrado tornam-se cada vez mais sincronizadas durante a estimulação optogenética e que o ritmo rítmico das células PV resulta em um controle robusto da frequência e da potência das oscilações (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Potencial de campo local e gravações simultâneas de patch clamp de neurônios piramidais e PV CA1 / SUB únicos durante oscilações Theta espontâneas e optogenéticas no hipocampo isolado.

(a) Diagrama mostrando os locais de registro de LFP e eletrodo de patch com a colocação do guia de fibra de luz acima da região CA1/SUB expressando uma opsina sens...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S9625
sacarose	Sigma Aldrich	S9378
bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - fosfato de sódio monobásico	Sigma Aldrich	S8282
Sulfato de magnésio	Sigma Aldrich	M7506
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	Pág. 3911
D-(+)-Glicose	Sigma Aldrich	G7528
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	C5080
Ascorbato de sódio	Sigma Aldrich	A7631-25G
equipamento
Mistura gasosa de 95% O2/5% CO2 (carbogênio)	Vitalaire	SG466204A	sistema de perfusão
Garrafas/frascos de vidro (4 x 1 L)	n.a.	n.a.	sistema de perfusão
Câmara de gravação submersa	projete (FM)	n.a.	Alternativa comercial pode ser usada
Amplificador de grampo de remendo Multiclamp 700B	Dispositivos moleculares	MULTICLAMP	Eletrofisiologia
Programa de Comando Multiclamp 700B	Dispositivos moleculares	MULTICLAMP	Eletrofisiologia
Conversor digital/analógico	Dispositivos moleculares	DDI440	Eletrofisiologia
Micromanipuladores (operados manualmente)	Siskiyou	MX130	eletrofisiologia (LFP)
Micromanipuladores (automatizados)	Siskiyou	MC1000e	eletrofisiologia (patch)
Monitor de áudio	Sistemas A-M	Modelo 3300	Eletrofisiologia
Microscópio de fluorescência vertical personalizado	Siskiyou	n.a.	imagiologia
Câmera de vídeo analógica	COHU	4912-2000/0000	imagiologia
Frame grabber digital com software de imagem	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	imagiologia
Objetiva Olympus 2.5x	Olimpo	MPLFLN	imagiologia
Objetiva de imersão em água Olympus 40x	Olimpo	UIS2 LUMPLFLN	imagiologia
Sistema de diodo emissor de luz (LED) feito sob medida	costume	n.a.	estimulação optogenética (Amhilon et al., 2015)
Animais
Camundongos PV::Cre (KI)	Laboratório Jackson	Número de estoque 008069	Permitir a expressão gênica direcionada por Cre em interneurônios PV
Camundongos Ai9 condicionais constitutivos (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Laboratório Jackson	Número de estoque 007905	Express TdTomato após recombinação mediada por Cre
Camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Laboratório Jackson	Número de estoque 012569	Expresse a proteína de fusão canalrodopsina-2/EYFP melhorada após exposição à Cre recombinase
Ratos PVChY	Criação em casa	n.a.	Descendentes obtidos a partir do cruzamento da linhagem PV-Cre com camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP