Avaliação de uma junção neuromuscular funcional por meio de estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo

Resumo

Fonte: Liberman, M., et al., Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra um método para avaliar as junções neuromusculares funcionais. Usando um biorreator contendo tecido muscular e neurônios motores, juntamente com microscopia fluorescente, os canais sensíveis à luz nos neurônios são estimulados a gerar sinais elétricos, causando contrações nas fibras musculares.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação do biorreator

1. Faça moldes de biorreatores
   1. Baixe um arquivo CAD (projeto auxiliado por computador) do biorreator do arquivo CAD suplementar ou crie um projeto personalizado.
   2. Gere um percurso CNC (Controle Numérico Computadorizado) a partir do modelo 3D usando o software CAM (Computer-aided manufacturing).
   3. Usinar moldes de acetal usando uma fresadora CNC.
2. Fabricação de biorreatores
   1. Misture uma base 10:1 para uma mistura de agente de cura de polidimetilsiloxano (PDMS, 77 g de mistura por 4 plataformas/moldes).
   2. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo, feche todas as válvulas, ligue o vácuo e desgaseifique a mistura por pelo menos 30 minutos até que não haja bolhas de ar. Despeje a mistura em moldes e desgaseifique os moldes na câmara de vácuo por 1 h.
   3. Feche os moldes com a metade superior do molde na orientação correta. Coloque uma haste hexagonal de aço sobre o centro e prenda em ambos os lados.
   4. Reabasteça a parte superior com PDMS.
   5. Catalise os moldes em forno a 65 °C durante pelo menos 4 h.
   6. Remova as plataformas dos moldes após esfriar até a temperatura ambiente.
   7. Limpe os dispositivos em um banho ultrassônico usando ciclos de 1 h de detergente, 400 mL de isopropanol 100% e água destilada.
   8. Secar durante a noite a 65 °C.
   9. Mergulhe as lamínulas de vidro em poliol surfactante não iônico a 1% por 30 min, certificando-se de que não se empilhem para que fiquem devidamente revestidas.
   10. Enxágüe bem com água destilada e seque durante a noite a 65 °C.
   11. Trate as lamínulas de vidro e a plataforma PDMS com um limpador de plasma em alta com 6 L/min de oxigênio por 1-2 min. Uma vez tratado, una os dois pressionando o PDMS para baixo na lamínula por pelo menos 30 s.
   12. Autoclave os dispositivos colados antes de adicionar células.

2. Construindo uma configuração de estimulação óptica

1. Usando um sistema de cubo de gaiola de 30 mm, conecte um espelho dicróico de 573 nm no centro. Acople um LED vermelho de 627 nm (diodo emissor de luz) com um filtro de excitação passa-longa de 594 nm e conecte-o na parte superior do cubo, com o LED voltado para o espelho. Em seguida, conecte um LED azul de 488 nm com um filtro de excitação passa-curta de 546 nm no lado adjacente do cubo, com o LED voltado para o espelho, conforme mostrado no esquema da Figura 1A.
2. Conecte um diafragma de íris acionado por anel na parte inferior do cubo da gaiola para controlar o tamanho da área iluminada.
3. Alimente cada LED com um driver de LED T-Cube e controle por meio de uma placa Arduino Uno Rev3. Conecte a entrada lateral do driver de LED a um plugue de fonte de alimentação, conecte a saída do meio ao Arduino e conecte a saída lateral diretamente aos LEDs.
4. Conecte o Arduino Uno a um computador com um cabo USB.
5. Baixe arquivos do link do GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Abra o arquivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" na pasta GitHub.
7. Defina os parâmetros iniciais: Steps = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Certifique-se de que a saída do pino 4 esteja atribuída ao driver de LED azul e a saída do pino 2 esteja atribuída ao driver de LED vermelho. Verifique se os fios do meio do driver de LED estão conectados ao terra e à respectiva saída do pino.
9. Compile e carregue o programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" no Arduino.
10. Conecte cada driver de LED ao canal correspondente.

3. Configuração da cultura celular (dia -21-0)

1. Células musculares esqueléticas primárias
   1. Descongele e expanda os mioblastos esqueléticos primários (obtidos do Cook Myosite) por no máximo seis passagens usando meio de crescimento miotônico (+ suplemento). Manter as células numa incubadora regulada para 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Mude a mídia a cada 2 dias.
   3. Quando as células estiverem cerca de 60% confluentes, passe-as usando 0,05% de tripsina-EDTA (1x, por 5 min a 37 ° C). Colete as células dissociadas e adicione novos meios para neutralizar a tripsina.
   4. Girar as células a 300 x g e aspirar o sobrenadante acima do sedimento celular.
   5. Ressuspender as células com MGM e semear 1:3 com 60 ml por balão de tripla camada.
2. ChR2-hiPSC
   nota: Todas as linhagens celulares para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA. Neste protocolo, hiPSCs que expressam ChR2 foram gerados por meio da edição do genoma CRISPR-Cas9 usando métodos descritos anteriormente 18 , mas qualquer linha celular optogenética estável (lentiviral, piggyBac, etc.) pode ser usada da mesma maneira. Promotores constitutivos expressos em iPSCs e motoneurônios foram escolhidos (CAG). Descobriu-se que as células tinham cariótipos saudáveis, conforme observado em publicações anteriores.
   1. Cubra as placas de 6 poços com 1 mL / poço de matriz de membrana basal solubilizada diluída em DMEM / F12 (1:80) e incube as placas em temperatura ambiente por 1 h.
   2. Semeie iPSCs em placas revestidas de 6 poços com 2 mL de meio de cultura de células sem alimentador (meio iPSC), trocando 2 mL de meio em dias alternados e passando a cada 5-7 dias. Mantenha as células em uma incubadora ajustada para 37 ° C e 5% de CO₂.
   3. Passagem
      1. Dissocie as células-tronco incubando-as com 1 mL de reagente liberador de células-tronco sem enzimas por 4 min e cortando-as mecanicamente com uma pipeta P1000 de ponta larga.
      2. Células de sementes na proporção de 1:24 ou 1:48 em meio iPSC com 2 μM de dicloridrato de Y-27632 em 2 mL/poço em placas revestidas de 6 poços.

4. Semeadura do tecido muscular esquelético (dia -3)

1. Isole e conte 30 x 106 mioblastos usando um contador de células automatizado.
2. Ressuspenda os mioblastos em uma mistura 4:1 de 3 mg/mL de colágeno I e matriz de membrana basal solubilizada (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de matriz de membrana basal para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizante que o acompanha (mistura 9:1 de colágeno ao agente neutralizante) e dilua a mistura com 1x PBS para atingir um volume de 800 μL.
3. Adicione 15 μL de suspensão de colágeno celular a cada câmara muscular do biorreator, certificando-se de espalhar a suspensão por ambos os pilares usando a ponta da pipeta (Figura 2).
4. Deixe a mistura célula-gel polimerizar a 37 ° C por 30 min e, em seguida, encha cada biorreator com 450 μL de meio de crescimento miotônico.
5. Após 3 dias (uma vez que o gel tenha compactado), comece a diferenciação do miotubo.

5. Diferenciação do miotubo (dias 0-14)

1. Inicie a infusão de miotubos trocando os tecidos para 450 μL de meios indutores de fusão (FS, Tabela 1) por 7 dias, trocando os meios a cada dois dias.
   nota: Tente iniciar a diferenciação do miotubo no mesmo dia da diferenciação de motoneurônios de hiPSCs, a fim de semear motoneurônios no final dos esquemas de diferenciação de ambos os tipos de células.
2. No dia 7, mude o meio para 450 μL de meio de maturação Ia (MMIa, Tabela 1).
3. No dia 9, mude para 450 μL de meio de maturação Ib (MMIb, Tabela 1).
4. No dia 11, mude o meio para 450 μL de NbActiv4. Continue trocando a mídia a cada 2 dias até que os motoneurônios sejam semeados (Etapa 7).

6. Diferenciação de motoneurônios (dias 0-14)

1. No dia 0, transfira 4 x 10⁶ ChR2- hiPSCs para uma placa de Petri de fixação ultrabaixa com 15 mL de meio de cultura em suspensão de motoneurônios (MSCM, Tabela 1). Suplemente MSCM com 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato e 5 μM de dicloridrato de Y-27632.
2. No dia 2, isole as neuroesferas (NS) com um filtro reversível de 37 μM e replaquee em 15 mL de MSCM com 3 μM de CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato e 0,1 μM de ácido retinóico. Após o dia 2, o SN deve ser visível na placa de Petri sem o uso de um microscópio.
3. No dia 4, transfira as células e o meio para um tubo de 50 mL e permita que as neuroesferas se depositem no fundo (5 min). Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mL de MSCM suplementado com 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 e 0,1 μM de ácido retinóico.
4. No dia 7, repita a Etapa 6.3., mas ressuspenda as células em 15 mL de MSCM suplementado com 0,5 μM de SAG e 0,1 μM de ácido retinóico.
5. No dia 9, repita a Etapa 6.3., mas ressuspenda as células em 15 mL de MSCM suplementado com 10 μM de DAPT.
6. No dia 11, repita a Etapa 6.3. mas ressuspenda as células em 15 mL de MSCM suplementado com 20 ng/mL de BDNF e 10 ng/mL de GDNF.
7. No dia 14, semeie os motoneurônios na plataforma.

7. Semeando agregados de motoneurônios no biorreator (dia 14)

1. Prepare uma mistura de gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I e Matrigel (800 μL de mistura de colágeno + 200 μL de Matrigel para atingir um volume final de 1 mL). Para o componente de colágeno, adicione o agente neutralizante que o acompanha (mistura 9:1 de colágeno ao agente neutralizante) e dilua a mistura com 1x PBS para atingir um volume final de 800 μL.
2. Use um filtro de células de 400 nm para selecionar grandes neuroesferas e ressuspendê-las na mistura de gel.
3. Aspire o meio do reservatório e cuidadosamente da neuroesfera (Figura 2).
4. Adicione 15 μL de mistura de gel no canal da neuroesfera.
5. Carregue uma pipeta de 10 μL com 10 μL de gel e, em seguida, escolha uma neuroesfera.
6. Deposite o SN no canal da neuroesfera e certifique-se de que o NS esteja na câmara. Levante lentamente a pipeta enquanto libera o gel restante assim que o NS for depositado. Se não tiver certeza de que o NS foi depositado corretamente, verifique sua localização usando um microscópio.
7. Deixe o gel polimerizar por 30 min a 37 °C.
8. Aos reservatórios, adicionar 450 μL de NbActiv4 suplementado com 20 ng/mL de BDNF e 10 ng/mL de GDNF.
9. Troque a mídia a cada dois dias para permitir o crescimento axonal de SN para tecido muscular.

8. Estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo da função NMJ (dia 24+)

1. Para imagens, use um microscópio fluorescente invertido com uma câmera científica de semicondutores de óxido de metal complementar (sCMOS).
2. Defina o binning do software da câmera para 2x2, a exposição para 20 ms, o obturador de rolamento LIGADO, a taxa de leitura para 540 MHz, a faixa dinâmica: 12 bits e ganho 1 e o modo do sensor: sobreposição.
3. Use a objetiva 2x no microscópio para obter imagens dos microtecidos.
4. Anexar uma câmara de células vivas (37 °C, 5% CO₂) à platina do microscópio.
5. Selecione a região de interesse (ROI) que contém o tecido esquelético inervado para minimizar o tamanho do arquivo e o tempo de processamento.
6. Coloque um filtro de emissão passa-longa de 594 nm entre a amostra e a objetiva de imagem para filtrar os pulsos de luz azul da câmera.
7. Coloque uma placa retangular de 4 poços contendo 4 biorreatores (24 tecidos) na câmara de células vivas.
8. Clique em Live View. Centralize e foque a imagem com o ROI desejado.
9. Carregue o código de macro personalizado da pasta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar a posição do palco, a placa Arduino e a aquisição de vídeo.
10. Defina o filme de saída como day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Execute o código de macro com as coordenadas X,Y desejadas definidas no palco e adquira um lapso de tempo rápido com 1700 quadros a 50 quadros/s.
12. Substitua o meio após a imagem e devolva as amostras à incubadora. Aguarde pelo menos 24 h entre as sessões de aquisição de imagens para evitar fadiga tecidual.

Resultados

Figura 1. Estimulação, registro e análise da função da JNM. (A) Esquema da configuração do LED e caminho da luz. (B) Configuração óptica com microscópio invertido, câmara de células vivas, platina automatizada e câmera sCMOS. (C) Algoritmo para o processamento em lote de vídeos de estimulação óptica de culturas NMJ. (D) O quadro repr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células
SkMDC	Cozinheiro Myosite	Pág. P01059-14M
Mídia e suplementos
DMEM/F12 avançado	ThermoFisher Scientific	Rolamento 12634-020
Solução de albumina de soro bovino	Millipore Sigma	A9576-50ML
Suplemento G-5 (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Antibiótico Seletivo Geneticina (Sulfato G418) (50 mg / mL)	ThermoFisher Scientific	Rolamento 10131-035
Insulina Humana Recombinante	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Tecnologias de células-tronco	100-0276
Kit de Meios de Crescimento MyoTonic	Cozinheiro Myosite	MK-4444
Suplemento N-2	ThermoFisher Scientific	17502-048
NBactiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nº 4-500
Meio Neurobasal	ThermoFisher Scientific	Rolamento 21103-049
Meio Neurobasal-A	ThermoFisher Scientific	A13710-01
F-127 Plurônico	Sigma Aldrich	Pág. 2443
ReLeSR	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 5872
Artigos de plástico
Sistema de cubo de gaiola de 30 mm	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 e ER2-P4
Filtro reversível de 37 μm, grande	Tecnologias de células-tronco	27250
Filtro de excitação passa-curta de 546 nm	Semrock	FF01-546/SP-25
Espelho dicróico de 573 nm	Semrock	FF573-DI01–25x36
Filtro de emissão passa-longa de 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
Filtro de excitação passa-longa de 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
LED Rebel azul (470nm) em uma base quadrada SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Fosco 10 mm Circular Beam Optic - Pernas Integradas	LuxeonStarLEDs	Rolamento 10413
Prato de cultura de fixação ultrabaixa Corning 60 mm	Corning	3261
Dissipador de calor	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
óptica
pluriFiltro 400 μm, embalagem com 25 unidades, estéril	PluriSelect	Telefone: 43-50400-03
pluriFiltro 500 μm, pacote de 25, estéril	PluriSelect	43-50500-03
LED Rebel vermelho (627nm) em uma base quadrada SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
Diafragma de íris acionado por anel	ThorLabs	SM1D12D
Drivers de LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Moldes
Espaçadores Hexagonais Roscados Fêmea, 3 1/2" 10-32, Parcialmente Rosqueados 1/2"	Mcmaster	Rolamento 91920A046
Braçadeira C de baixo perfil	Mcmaster	1705A12
Fatores de crescimento
Adenosina 3′,5′-monofosfato cíclico	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	Rolamento 4423-10
DAPT 10 mg	Sistemas de P&D	Rolamento 2634-10
CNTF humano, grau de pesquisa, 5 μg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Proteína Vitronectina Humana, FC	Sistemas de P&D	2349-VN-100
Proteína Vitronectina Humana, FC	Sistemas de P&D	2349-VN-100
Proteína humana recombinante IGF1	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Proteína natural de laminina de camundongo	ThermoFisher Scientific	23017015
Proteína Agrin Humana Recombinante	Sistemas de P&D	6624-AG-050
Proteína GDNF humana recombinante, CF 50ug	Sistemas de P&D	212-GD-050/CF
Neurotrofina Humana Recombinante 3 100 ug	Ciências Celulares	CRN500D
Neurotrofina-4 humana recombinante	Ciências Celulares	CRN501B
Ouriço sônico humano recombinante / SHH (C24II) N-Terminus	Sistemas de P&D	1845-SH-100
Humano Recombinante/Murino/Rato BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Ácido Retinóico, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
Agonista suavizado SAG	Millipore Sigma	Rolamento 566660
SB431542 10 mg	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 72234
HasteMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectina de plasma humano	Millipore Sigma	Rolamento V8379-50UG
Cloridrato de Y-27632	Tocris	1254
Anticorpos
α-actinina mAb (IgG1 de camundongo)	Abcam	AB9465
Colina Acetiltransferase (ChAT) (Cabra)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (IgG1 de camundongo)	Dako	M076029-2
Cadeia pesada de miosina (MHC) (camundongo IgG2b)	DSHB	MF20
equipamento
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Estágio automatizado	Instrumentação científica aplicada	MS- 2000 XYZ
Limpador de plasma expandido	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Contador de células automatizado Invitrogen Countess	Marechal Científico	O CACC
IX-81 Microscópio de fluorescência invertida	Olimpo	IX-ILL100LH
Sistema de incubadora de topo de estágio de série	Tokai atingiu STX	TOKAI-HIT-STXG
Câmera Zyla 4.2 sCOMS	Tecnologia Andor	ZYLA-4.2P-CL10
software
Software Arduino (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam para Solidworks
Laboratório de Matemática	Laboratório de Matemática	R2021b
Elementos NIS	Nikon	Pesquisa Básica
CAD 3D do Solidworks	Solidworks	Padrão do Solidworks