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1. Preparação da linha celular
- Descongele aproximadamente 1.000.000 de células da medula espinhal de neuroblastoma de camundongo (células NSC-34) que foram armazenadas em um recipiente de nitrogênio líquido. Use uma incubadora de água a 37 °C até que as células estejam totalmente descongeladas.
- Adicione meio fresco e quente (meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos pen-strrep).
- Centrifugar células descongeladas (SL16R) a 500 x g por 5 min, formando um pellet celular. Descarte o meio e adicione 1 mL de novo meio para a ressuspensão celular.
- Colocar as células ressuspensas num balão de 15 ml e adicionar mais 5 ml de meio. Incubar as células durante a noite em uma incubadora estéril com 5% de CO2 a 37 °C.
- Paralelamente, colocar 8 lamínulas não revestidas (lamínula: 12 mm, 0,13-0,17 mm de espessura) numa placa de cultura de 60 mm e esterilizar com etanol a 70% e exposição a 30 min de luz UV até secar. Adicione o meio a cada prato e descarte para lavar o etanol residual.
- Adicione tampão tripsina (2,5 g de tripsina e 0,2 g de EDTA em 1 L de solução salina balanceada de Hanks) às células depois que elas atingirem aproximadamente 90% de confluência (cerca de 6 milhões de células por frasco) para permitir que as células aderentes se dissociem.
NOTA: As células NSC-34 são sensíveis e requerem apenas 15 s de incubação de tampão tripsina e 1 minuto adicional de incubação livre de tripsina antes da dissociação usando o meio.
- Colocar as células nas placas de cultura de 60 mm que já contêm as lamínulas com 3 ml de meio, cerca de 350.000 por placa. Deixe-os na incubadora por 24 h para permitir a fixação das células nas lamínulas.
2. Validação da Expressão Proteica
- Colocar no gelo as placas de cultura de 60 mm contendo as células residuais (não utilizadas na experiência acima) de cada grupo experimental.
- Descarte o meio e lave as células duas vezes com PBS para diluir e lavar o meio restante.
- Trate as células com 200-400 μL de tampão de lise contendo PBS, Triton a 0,5% e comprimido de coquetel inibidor de protease (PI). Raspe usando um raspador de células.
- Colete as células em tampão de lise em um tubo de microcentrífuga e homogeneize com um homogeneizador a 4.000 rpm por 1 min sob gelo.
- Centrifugue as células homogeneizadas a 2.500 x g por 10 min. Colete o sobrenadante, quantifique a concentração de proteína usando um ensaio de Bradford e armazene a -20 ° C até o uso.
- Colete entre 30 e 70 μg de proteína total (dependendo da proteína) e carregue-a em um gel SDS-PAGE para testar a expressão da proteína usando um ensaio de immunoblot.