1. Determinando a expressão relativa de proteínas de superfície celular em astrócitos por biotinilação
NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula de matriz extracelular laminina na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina (sulfosuccinimidil 6-(biotinamido) Hexanoato) e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais).
- Utilizando o método, preparar culturas de astrócitos corticais cerca de 2 semanas antes do ensaio e cultivá-las em balões de cultura de 75 cm2 ventilados. Quando os astrócitos estiverem 80 - 90% confluentes, separe-os da superfície da cultura usando 0,05% de tripsina e, em seguida, passe-os 1:3.
- Às 48 h antes do ensaio, quando as células estão novamente 80 - 90% confluentes, os astrócitos passam 1:3 (levando em conta a mudança no formato da cultura) para placas de cultura de células de 60 mm, de modo a que estejam >70% confluentes no dia em que a experiência deve ser realizada. Certifique-se de que as células estejam distribuídas uniformemente entre os pratos.
- Às 16 h antes do ensaio, pipetar a laminina para o meio de cultura até uma concentração final de 24 nM e incubar a 37 °C.
- Imediatamente antes do ensaio, prepare o seguinte e, em seguida, coloque no gelo ou leve à geladeira: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O e 100 mg/L CaCl2 em solução salina tamponada com fosfato 1X [PBS], pH 7,4), tampão biotina (0,5 mg/mL sulfo-NHS-LC-biotina em CM-PBS), tampão de têmpera (50 mM NH4Cl em CM-PBS), tampão de lise (25 mM Tris, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e ácido etilenodiaminotetracético 5 mM [EDTA], triton X-100 a 1%, coquetel inibidor de protease 1X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, dodecil sulfato de sódio a 6% [SDS], glicerol a 30%, ditiotreitol [DTT] a 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (Tris 10 mM (pH 7,4), EDTA 1,5 mM, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X coquetel inibidor de protease).
- Remova os pratos que contêm as culturas de astrócitos da incubadora e descarte o meio.
- Lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e coloque a louça em gelo picado.
- Pipete 2 mL de tampão de biotina em cada poço e incline suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir a cobertura completa. Deixe no gelo por 30 min.
- Remova o tampão de biotina usando um aspirador e substitua-o por um tampão de têmpera de 4 mL. Deixe no gelo por 10 min.
- Aspire o tampão de têmpera e substitua-o por um volume equivalente do mesmo. Novamente, deixe no gelo por 10 min.
- Descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS resfriado.
- Raspe as células em 1 mL de CM-PBS resfriado usando um levantador de células e transfira a suspensão para o tubo de microcentrífuga.
- Células em pellets por centrifugação a 100 x g durante 3 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de tampão de lise.
- Deixe as amostras no gelo por 30 min, vórtice a cada 5 min, ou coloque-as em um rotador de ponta a ponta a 4 ° C.
- Centrifugue o lisado a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C para granular quaisquer materiais insolúveis em detergente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Economize 50 μL deste lisado e adicione tampão de carregamento a ele. Em seguida, desnature-o aquecendo-o a 95 °C em banho seco; Esta é a fração de "entrada", contendo proteínas da superfície celular biotiniladas, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas.
- Alargue a abertura da ponta de uma pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material de sua extremidade usando uma tesoura afiada. Usando esta ponta de pipeta, transfira 75 μL de esferas de estreptavidina-agarose (normalmente armazenadas a 4 ° C) para o lisado e incube a 4 ° C por 3 h em agitador / balancim.
- Como a estreptavidina-agarose é frequentemente vendida como uma pasta contendo 50% de grânulos por volume, suspensa em uma solução antimicrobiana, triturar a pasta para garantir que os grânulos sejam suspensos uniformemente e, em seguida, pipetar 150 μL da suspensão em cada amostra.
- Grânulos de estreptavidina-agarose em pellets por centrifugação a 1500 x g durante 30 s a 4 °C.
- Economize 50 μL do sobrenadante (adicione tampão de carga e desnature-o a 95 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento); isso representa a fração "intracelular" e é composto principalmente de proteínas citosólicas não biotiniladas.
- Ressuspenda os grânulos peletizados em tampão de lavagem de 1 mL e agite-o por 3 min a 4 ° C. Estampa dos grânulos (como na etapa 1.16) e descarte o sobrenadante. Repita esse processo 4x para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas.
- Peletar os grânulos por centrifugação (1500 x g durante 30 s a 4 °C) e rejeitar o tampão de lavagem sobrejacente. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Liberar biotina e estreptavidina das contas desnaturando-as a 95 °C; Esta fração deve conter apenas proteínas biotiniladas da superfície celular (fração "superfície celular").
- Separe as frações de entrada, superfície celular e intracelular por SDS-PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida) e analise por western blotting.
nota: Embora tenhamos usado um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossos experimentos, um gel de separação de 12 a 14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada uma contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Deve também ser utilizado um padrão de peso molecular com a gama de tamanhos adequada. Observe que às vezes pode haver um aumento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas.