Avaliação da internalização de proteínas de superfície alvo usando um derivado de biotina

Abstract

Fonte: Tham, D. K. L., et al., Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrócitos usando biotinilação. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um método para avaliar a internalização da proteína-alvo nos astrócitos corticais de camundongos usando biotinilação, seguida de lise celular, extração de proteína à base de estreptavidina, desnaturação e análise de Western blot para confirmar a internalização bem-sucedida.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Determinando a taxa de internalização de proteínas de superfície celular em astrócitos por biotinilação

NOTA: A seguir, descrevemos um experimento típico de biotinilação de perseguição de pulso usado neste caso para rastrear a endocitose de AQP4 em astrócitos. Os materiais especializados necessários incluem sulfo-NHS-SS-biotina, resina estreptavidina-agarose, glutationa reduzida e iodoacetamida (ver Tabela de Materiais).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9647-50
Azul de bromofenol	Bio-Rad	#1610404
Coquetel completo de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	11697498001
Etilenodiaminotetraacetato dissódico di-hidratado (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Ditiotreitol (TDT)	Bio-Rad	#1610611
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco / Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotina	Thermo Fisher Científico	#21331
Soro fetal bovino	Gibco / Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glicerol	Fisher Científico	BP229-1
glicina	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamida	Bio-Rad	#163-2109
L-glutamina	Gibco / Thermo Fisher Scientific	Rolamento 25030-081
Penicilina/estreptomicina	Gibco / Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Laboratórios Jackson ImmunoResearch	111-035-045
Tampão fosfato salino	Gibco / Thermo Fisher Scientific	10010-023
Glutationa reduzida	Sigma-Aldrich	G6529
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Científico	S271-500
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	Rolamento 862010
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Científico	S318-100
Resina de estreptavidina agarose	Thermo Fisher Científico	#20347
Anticorpo policlonal anti-AQP4 de coelho	Alomone	AQP-004
Base Tris (base Trizma)	Fisher Científico	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Científico	BP153-1
Tritão X-100	Fisher Científico	BP151-500