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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Determinando a taxa de internalização de proteínas de superfície celular em astrócitos por biotinilação
NOTA: A seguir, descrevemos um experimento típico de biotinilação de perseguição de pulso usado neste caso para rastrear a endocitose de AQP4 em astrócitos. Os materiais especializados necessários incluem sulfo-NHS-SS-biotina, resina estreptavidina-agarose, glutationa reduzida e iodoacetamida (ver Tabela de Materiais).
- Prepare culturas de astrócitos corticais de camundongos em placas de 60 mm usando os métodos descritos na seção anterior. Certifique-se de que as células sejam aproximadamente 70% confluentes no dia do ensaio e que cada placa contenha um número equivalente de células.
- Imediatamente antes do ensaio, prepare o seguinte e coloque no gelo ou leve à geladeira: CM-PBS ou solução salina tamponada com fosfato (100 mg/L MgCl2∙6H2O e 100 mg/L CaCl2 em 1X PBS, pH7,4), tampão biotina (0,5 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotina em CM-PBS), tampão redutor (50 mM de glutationa reduzida, 75 mM de NaCl e 75 mM de NaOH), tampão de têmpera (50 mM de iodoacetamida, 1% de BSA, em CM-PBS), tampão de lise (25 mM de Tris, pH 7,4, 25 mM de glicina, 150 mM de NaCl e 5 mM de EDTA ou ácido etilenodiaminotetracético, 1% de triton X-100, 1X coquetel de inibidores de protease), 3X tampão de carga (150 mM de Tris, pH 6,8, 6% de SDS ou dodecil sulfato de sódio, 30% de glicerol, 300 mM de DTT ou Ditiotreitol e 0,01% de azul de bromofenol), e tampão de lavagem (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 1%, coquetel inibidor de protease 1X).
- Prepare o meio de cultura de células frescas (Dulbecco's Modified Eagle Medium; ou DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina) e coloque-o em banho-maria a 37 °C.
- Remova as culturas de astrócitos da incubadora e aspire o meio usando um aspirador.
- Lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS resfriado e coloque os pratos em gelo picado.
- Pipete 3 mL de tampão de biotina em cada prato, incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe no gelo por 30 minutos.
- Aspire o tampão de biotina e substitua-o por 5 mL de meio quente. Incubar uma placa de cultura a 37 °C durante 15 min e uma segunda placa à mesma temperatura durante 30 min. Deixar outra placa a 4 °C como amostra de 0 min.
- No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS resfriado. Pipete 6 mL de tampão redutor sobre as células e deixe-as no gelo por 15 min.
- Remova o tampão redutor e substitua-o por 6 mL de tampão redutor novo. Coloque a mistura no gelo por mais 15 minutos.
- Remova a solução redutora e substitua-a por um tampão de têmpera de 6 mL. Deixe no gelo por 15 min.
- Repita a etapa de têmpera mais uma vez.
- Descarte o tampão de têmpera e lave as células três vezes com 4 mL de PBS resfriado.
- Usando um elevador de células, raspe as células em 1 mL de PBS resfriado e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.
- Células de pellets por centrifugação a 100 x g por 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em tampão de lise de 500 μL.
- Deixar no gelo durante 30 min e vórtice de 5 em 5 min. Em alternativa, colocar as amostras num rotador de ponta a ponta a 4 °C durante este período.
- Centrifugue o lisado a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C para granular os materiais insolúveis em detergente e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 μL deste lisado, adicione tampão de carga e desnature a 95 ° C em um banho seco; Esta é a fração de "entrada", contendo proteínas endocitadas biotiniladas e proteínas não biotiniladas.
- Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 μL da pasta estreptavidina-agarose ao lisado e incube a 4 ° C por 3 h em um agitador / balancim.
- Grânulos de estreptavidina-agarose por centrifugação a 1.500 x g durante 30 s a 4 °C.
- Ressuspenda os grânulos em tampão de lavagem de 1 mL e agite por 3 min a 4 ° C. Pellet grânulos (conforme o passo 1.18) e descarte o sobrenadante. Repita esse processo 4 vezes para minimizar a ligação inespecífica de proteínas citosólicas não biotiniladas.
- Centrifugar grânulos de pellets a 1.500 x g durante 30 s a 4 °C e rejeitar o tampão de lavagem sobrejacente. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Liberar biotina e estreptavidina das esferas por desnaturação a 95 °C; Esta fração deve conter apenas proteínas internalizadas da superfície celular (fração "endocitada").
- Separe as frações de entrada, superfície celular e não ligadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e analisadas por western blotting.
nota: Embora tenhamos usado um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossos experimentos, um gel de separação de 12 a 14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada uma contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Deve também ser utilizado um padrão de peso molecular com a gama de tamanhos adequada. Observe que às vezes pode haver um aumento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas.