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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de matrizes
- Ferva 4-8 matrizes de silicone no micro-ondas ou em uma placa quente por 5 min e deixe-as secar completamente por 1 h sob fluxo laminar (lado listrado para cima).
nota: Os procedimentos a seguir devem ser realizados sob fluxo laminar.
- Sopre ar comprimido ou use fita adesiva transparente para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Mantenha o lado listrado limpo para que possa aderir firmemente à superfície da placa.
- Coloque cuidadosamente as matrizes em pratos de plástico de 6 cm pressionando com um dedo (uma matriz por prato; lado da faixa voltado para baixo). Evite deixar bolhas de ar entre a matriz e o prato. Marque a localização das listras na parte inferior do prato de cultura.
- Se a matriz não for conectada, repita a partir da etapa 1.2.
2. Geração de listras e revestimento de laminina para cultura de neurônios
- Prepare a proteína recombinante marcada com fluorescência (25 μl cada para injeção [etapa 2.2] ou 100 μl cada para o método de colocação [etapa 2.2.1]) misturando a proteína marcada com Fc (10-50 μg / ml) e um anticorpo Fc humano conjugado com corante fluorescente (proporção de 1 para 3: 30-150 μg / ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, incube a mistura por 30 min em RT.
- Usando uma seringa de 22 G, injetar 25 μl da proteína recombinante preparada na etapa anterior (2.1) através do pequeno orifício na lateral da matriz (setas na Figura 1A, 1C e 1E).
- Alternativamente, coloque 100 μl da proteína recombinante na fenda superior da matriz e aspire aproximadamente metade da solução do pequeno orifício (setas na Figura 1A, 1C e 1E), de modo que a proteína recombinante permaneça nas regiões listradas.
- Incubar a placa durante 30 min a 37 °C numa incubadora de cultura de células.
- Colocar 300 μl de PBS na fenda superior (Figura 1B) e aspirar a partir do pequeno orifício situado na parte lateral da matriz (setas na figura 1A, C e E) para remover as proteínas recombinantes não aderidas. Não aspire o PBS completamente, porque as proteínas vão secar. Repita esta etapa duas vezes. (3 vezes no total)
- Remova cuidadosamente a matriz e coloque imediatamente ~ 100 μl de proteína de controle (10-50 μg / ml; Fc) para cobrir toda a área listrada, criando um revestimento alternativo. Em seguida, incubar a placa durante 30 min a 37 °C na incubadora de cultura de células.
- Depois de lavar a superfície do prato três vezes com PBS, cubra-o com ~100 μl de 20 μg/ml de laminina em PBS.
nota: A laminina deve ser descongelada no gelo para evitar a solidificação.
- Incubar a cápsula durante 1 h a 37 °C na incubadora de cultura de células.
- Lave a superfície do prato três vezes com PBS e adicione meio de cultura. Colocar a placa revestida com meio de cultura numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C até à utilização.
3. Cultura de neurônios do hipocampo a partir de embriões de camundongos E15.5
- Eutanásia da mãe por luxação cervical e isole três embriões E15.5.
- Corte a pele e o crânio sagitalmente na linha média da cabeça com uma tesoura e remova o cérebro usando uma colher pequena. Transfira o cérebro cuidadosamente para uma placa de Petri de 60 mm contendo 3 ml de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Usando um bisturi, corte os hemisférios, incluindo córtex, hipocampo e estriado (Figura 2A). Em seguida, dissecar a região hipocampal, retirando cuidadosamente as meninges, e transferir os tecidos hipocampais dissecados para um tubo centrífugo de 15 ml contendo 2 ml de solução de HBSS, em gelo (Figura 2B-C). Colete 6 hipocampos de 3 embriões no tubo, que são suficientes para cultivar neurônios em 8 pratos.
- Substitua a solução de HBSS por uma solução de tripsina/etilenodiamina tetracética (tripsina/EDTA) (2 ml) e incube o tubo a 37 °C durante 15 min em banho-maria.
nota: Aspirar HBSS sem centrifugação e não decantar a solução HBSS inclinando o tubo.
- Neutralize a atividade da tripsina adicionando 500 μl de soro fetal bovino (FBS).
- Centrifugar a mistura a 100 x g durante 5 min. Retirar o sobrenadante e lavar o sedimento com 2 ml de meio de cultura. Repita esta etapa mais uma vez.
- Pipete o hipocampo para cima e para baixo 10 vezes em meio de cultura usando uma ponta de 1.000 μl com um grande orifício (ponta cortada) para dissociar o tecido.
- Mude para uma ponta regular (sem cortes) de 1.000 μl e pipete o tecido dissociado para cima e para baixo para obter uma suspensão de célula única.
- Separe as células individuais passando-as por um filtro de células de malha de 80-100 μm.
- Centrifugue a suspensão monocelular filtrada a 150 x g durante 5 min.
- Remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender o sedimento (neurónios) em 2 ml de meio de cultura.
- Conte as células usando um hemocitômetro com coloração de azul de tripano para determinar a densidade e a viabilidade. Em seguida, coloque 10.000 neurônios em 150 μl de meio de cultura para cada conjunto de listras. A suspensão deve ser colocada com cuidado para cobrir toda a região da listra.
