Entrega de uma lesão cerebral traumática no cérebro de um camundongo

Resumo

Fonte: Zhong, J., et al. Imagem intravital da expressão de proteínas fluorescentes em camundongos com lesão cerebral traumática de crânio fechado e janela craniana usando um microscópio de dois fótons. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra a aplicação de traumatismo cranioencefálico (TCE) em camundongos. Depois de expor o crânio, o local do TCE é marcado. O mouse é então posicionado sob o dispositivo TBI. O impacto é feito levantando a haste de metal e permitindo que ela caia livremente sobre o impactor, que está em contato com o crânio.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Administração de uma indução de traumatismo cranioencefálico repetitivo (TCE)

NOTA: Os parâmetros do TCE são ajustados a partir de relatórios anteriores, nos quais o impacto do TCE foi entregue uma vez. O protocolo aqui aplica o mesmo parâmetro, exceto aumentando o número total de impacto para 10.

1. Equipamento TBI
   1. Use um dispositivo portátil personalizado para administrar um TCE de crânio fechado (Figura 1A) na cabeça do mouse no lado direito, conforme indicado na Figura 1B.
2. Preparação antes da cirurgia
   1. Equipamento de cirurgia em autoclave, incluindo tesoura comum, paquímetro cirúrgico, tesoura de mola cirúrgica, pinça cirúrgica, pinça de mosquito, peças de poste de cabeça, gaze e aplicadores com ponta de algodão.
   2. Pese e registre o peso corporal do camundongo 2 h antes da cirurgia. Para minimizar o edema cerebral durante o implante da janela craniana, injete fosfato de sódio com dexametasona na dose de 4,8 mg/kg [2 mg/mL, geralmente ~70 μl (é necessário injetar em dois locais)] no músculo quadríceps usando uma seringa de insulina. Após a injeção de dexametasona, mas antes de iniciar a cirurgia de TCE, prepare as janelas de vidro conforme indicado na etapa 2.1 para uso posterior.
   3. Desinfetar o estágio cirúrgico e o equipamento de TCE com etanol a 75%. Expanda o campo cirúrgico estéril descartável para cobrir o estágio cirúrgico na plataforma estereotáxica. Ligue o aparelho de aquecimento e o monitor de temperatura, regulando a temperatura alvo para 37 °C.
   4. Abra a válvula do tanque de oxigênio e ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Abra a máquina de anestesia e ajuste o valor do nível de isoflurano para três.
      NOTA: O oxigênio 100% puro pode ajudar o animal a sobreviver aos impactos do TCE.
   5. Coloque o mouse na câmara de indução e deixe-o ficar por 5 minutos para obter a anestesia completa.
   6. Uma vez que o camundongo esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, em aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça da cauda), remova o camundongo da câmara de indução e coloque a cabeça do camundongo no quadro estereotáxico.
   7. Coloque o cone do nariz do tubo de anestesia sobre o focinho do mouse.
   8. Manter a anestesia com isoflurano a 1,5% misturado com oxigênio 100% puro a uma taxa de fluxo de 1 L/min até o final da cirurgia. Verifique periodicamente a frequência respiratória e aplique uma pinça na cauda ou no dedo do pé pelo menos a cada 15 minutos durante a cirurgia para avaliar a anestesia adequada. Ajuste a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade desejada da anestesia.
3. Cirurgia de TCE
   1. Administre buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) usando seringas descartáveis de insulina e aplique pomada oftálmica nos olhos do camundongo.
   2. Retire o cabelo do topo da cabeça aparando-o com uma tesoura 1 e depois aplicando um agente depilatório por 1 min.
      CUIDADO: Não aplique o produto depilatório por mais de 3 minutos no couro cabeludo, pois é um irritante para a pele. Além disso, evite colocar qualquer agente depilatório nos olhos do rato.
   3. Limpe a pele do couro cabeludo aplicando gaze e aplicadores com ponta de algodão. Em seguida, desinfete a pele, usando primeiro etanol 75% e depois betadina. Repita isso três vezes (ou seja, etanol seguido de betadina), deixando a aplicação final de betadina na pele.
   4. Verifique novamente a profundidade do anestésico para garantir que o camundongo esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, em aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça da cauda). Cubra a pele com uma pinça cirúrgica 3 e faça uma incisão na linha média de 12-15 mm de comprimento, começando aproximadamente 3 mm depois dos olhos.
   5. Extirpar a pele sobre os hemisférios esquerdo e direito do crânio usando uma tesoura de mola 2.
   6. Assim que o crânio estiver exposto, remova o periósteo esfregando-o suavemente com um aplicador estéril com ponta de algodão e lavando-o com solução salina estéril.
   7. Inspecione visualmente a condição do crânio para garantir que ele esteja intacto, exceto pelos dois pequenos orifícios, que foram feitos para a cirurgia de injeção de vírus anterior.
   8. Seque a área do crânio e marque o local do impacto do TCE nas seguintes coordenadas: 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral da sutura sagital à direita (Figura 1B).
   9. Remova rapidamente o mouse da estrutura estereotáxica e coloque a cabeça na almofada de buffer sob o dispositivo TBI.
   10. Alinhe a ponta do impactor com o local de impacto marcado.
   11. Levante a coluna de metal puxando a corda de náilon amarrada 15 cm acima da cabeça do mouse e solte-a, permitindo que o peso caia livremente sobre a haste do transdutor, que está em contato com o topo do crânio no local do TCE. Não toque na cabeça do mouse ao aplicar o impacto do TBI.
   12. Mova o mouse para o cobertor de aquecimento e coloque-o de costas enquanto monitora o estado de respiração.
   13. Uma vez que o camundongo se endireitar de uma posição supina para uma posição prona, coloque-o na câmara de indução de isoflurano por ~ 5 min com 3% de isoflurano misturado com oxigênio 100% puro a uma taxa de fluxo de 1,5 L / min.
   14. Quando o camundongo estiver totalmente sedado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, em aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça da cauda), repita as etapas 1.3.9-1.3.14 para obter um total de 10 impactos.
       NOTA: Dez impactos de TCE foram encontrados para induzir fenótipo robusto com baixa mortalidade de camundongos em nosso estudo (dados ainda não publicados). Os parâmetros podem ser ajustados para atingir uma gravidade diferente de lesão cerebral, aumentando ou diminuindo o número de impactos e/ou a altura a partir da qual o peso é liberado. Todos os parâmetros estão sujeitos à aprovação da IACUC local.
   15. Verifique o crânio sob um microscópio cirúrgico e remova o camundongo do estudo se ocorreu uma fratura no crânio.
   16. Para cirurgia simulada, siga os mesmos procedimentos descritos acima, incluindo colocar o animal sob o impactador, mas sem causar os impactos do TCE.
   17. Depois que o camundongo se endireitar de uma posição supina para uma posição prona após o 10º impacto do TCE, coloque-o na câmara de indução de isoflurano por ~ 5 min. Em seguida, siga as etapas 1.2.6-1.2.8 para colocar a cabeça do mouse na estrutura estereotáxica para a cirurgia de implantação da janela craniana descrita abaixo.

Resultados

Figura 1: Diagramas para o dispositivo TBI, local de impacto TBI e preparação da janela. (A) Equipamento para o dispositivo TBI de queda de peso. 1: pedestal, 2: suporte, 3: braçadeira ajustável, 4: corda de nylon, 5: túnel de queda de peso, 6: coluna de peso de metal (50 g), 7: impactor, 8: almofada tampão. (B) Um esquema do local de injeção do vírus e do impacto do TCE, com as coordenadas 2,5 mm po...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pincéis aplicadores de precisão ajustáveis	Parkell	S379
Seringa de insulina BD	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	Incluindo 7,5% de iodopovidona
Buprenorfina	PAR Farmacêutica	NDC 42023-179-05
Etonal	Fisher Científico	04355223EA	75% de sucesso
Aparelhos de aquecimento	CWE	Mouse TC-1000	Equipado com o instrumento estereotáxico e ser usado durante a cirurgia cirúrgica
Manta de aquecimento	Farmácia CVS	E12107	Dispositivo de aquecimento extra e ser usado após a cirurgia
Pomada oftálmica lubrificante	Picetal	NDC 46066-753-55
marcador	Delasco	SMP-BK
Pinça de mosquito	Carolina	Item #:625314	Aço inoxidável, curvo, 5 pol
Agente depilatório	Corporação McKesson	N/A	Loção de Depilação de Aloe & Lanolina Nair Hair
Tesoura regular 1	Eurostat	Eurostat ES5-300
Tesoura regular 2	Instrumentos de precisão mundiais	Nº 501759-G
salino	Biomundo	L19102411PR
Tesoura de mola 1	Instrumentos de precisão mundiais	Nº 91500-09	Ponta reta
Tesoura de mola 2	Instrumentos de precisão mundiais	Nº 91501-09	Ponta reta
Plataforma estereotáxica	KOPF	Modelo 900LS
Pinça cirúrgica 1	CIÊNCIAS DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA	Catlog# 0508-5/45-PO	Estilo 5/45, curvo
Pinça cirúrgica 2	CIÊNCIAS DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA	catlog# 0103-5-PO	Estilo 5, reto
Pinça cirúrgica 3	CIÊNCIAS DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA	registro do gato# 72912
Pinça cirúrgica 4	CIÊNCIAS DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA	Catlog# 0508-5/45-PO	Estilo 5/45, curvo
Lâmpada cirúrgica	Leica	Leica KL300 LED
Adesivo de tecido Vetbond	Cuidados com animais 3M	Número da peça:014006