Imunocoloração de fluorescência de neurônios do hipocampo de ratos dentro de um chip microfluídico

Resumo

Fonte: Nagendran, T., et al., Uso de chips microfluídicos de plástico pré-montados para compartimentar neurônios murinos primários. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de neurônios do hipocampo de ratos cultivados em um chip microfluídico para analisar a maturação e conectividade neuronal.

Protocolo

1. Imunocoloração de fluorescência dentro do chip

1. Prepare a solução de fixação de formaldeído a 4% em PBS (formaldeído a 4%, 1 μM de MgCl₂, 0,1 μm de CaCl₂, 120 mM de sacarose)
2. Remova a maior parte da mídia nos poços do cavaco (não seque os compartimentos internos).
3. Adicione imediatamente 100 μL de solução de fixação aos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.
4. Após 1 min, adicione 100 μL de solução de fixação aos poços inferiores. Fixe por 30 min em temperatura ambiente.
5. Remova a maior parte da solução dos poços do cavaco (não seque os compartimentos internos). Adicione imediatamente 150 μL de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde 2 minutos para que o PBS flua para os poços inferiores.
6. Repita a etapa 1.5 duas vezes.
7. Remova a maior parte do PBS dos poços do chip. Adicione imediatamente 150 μL de PBS com 0,25% de TritonX-100 a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde 15 min.
8. Remova a maior parte do líquido dos poços do chip e adicione imediatamente 150 μL de solução de bloqueio (10% de soro de cabra normal em PBS) a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde 15 min.
   nota: Soluções de bloqueio eficazes devem ser específicas para o anticorpo secundário, por exemplo, para um anticorpo secundário anti-ovelha de burro, use soro de burro na solução de bloqueio.
9. Remova a maior parte do líquido dos poços do chip e adicione imediatamente 100 μL de anticorpo primário (ou anticorpos) em soro de cabra normal a 1% em PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Cubra para minimizar a evaporação e aguarde 1 h em temperatura ambiente ou 4 °C durante a noite.
10. Remova a maior parte da solução dos poços do cavaco (não seque os compartimentos internos). Adicione imediatamente 150 μL de PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Aguarde 5 minutos para que o PBS flua para os poços de fundo.
11. Repita a etapa 1.10 duas vezes.
12. Remova a maior parte do líquido dos poços do chip e adicione imediatamente 100 μL de anticorpo secundário (ou anticorpos) em PBS a cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático. Cubra para minimizar a evaporação e aguarde 1 h em temperatura ambiente.
    nota: Consulte as instruções do fabricante para obter a diluição recomendada de anticorpos secundários.
13. Repita as etapas 1.10-1.11.
14. Se a imagem estiver dentro de 1 dia após a imunocoloração, mantenha o chip preenchido com PBS. Se o chip for armazenado por mais de 1 dia antes da imagem, embrulhe o prato que contém o chip em filme de parafina para evitar a evaporação e armazene-o a 4 °C até que esteja pronto para a imagem.
15. Para armazenamento de amostras a longo prazo, pode ser usado meio de montagem (por exemplo, Fluoromount-G).
    1. Remova a maior parte do líquido dos poços do chip. Use uma pipeta de plástico descartável de 1 mL para adicionar 2 gotas de meio de montagem em cada um dos poços superiores dos compartimentos axonal e somático.
    2. Incline o chip para estimular o fluxo da mídia de montagem através dos canais. Após 5 min, adicione 2 gotas nos poços inferiores. Aguarde 1 h antes de fazer a imagem.
       nota: Depois de usar a mídia de montagem, não será possível sondar novamente outros alvos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
XonaChip	Xona Microfluídica, LLC	XC150	Barreira de microranhuras de 150 μm de comprimento
XonaChip	Xona Microfluídica, LLC	XC450	Barreira de microranhuras de 450 μm de comprimento
XonaChip	Xona Microfluídica, LLC	XC900	Barreira de microranhuras de 900 μm de comprimento
Pré-revestimento XC	Xona Microfluídica, LLC	Pré-revestimento XC	incluído com XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluídica, LLC	XonaPDL
Meio neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049
Pipetas Glass Pasteur	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Perfure 16% de formaldeído	ThermoFisher Scientific	Rolamento 28906
PBS (10x)	ThermoFisher Scientific	QVC0508
Soro de cabra normal	ThermoFisher Scientific	16210064
Tritão X-100	ThermoFisher Scientific	Rolamento 28314
Anticorpo anti-vGlut1	NeuroMab	Telefone: 75-066	clone N28/9, 1:100
Alexa Fluor anticorpos secundários	ThermoFisher Scientific		17:40
Sistema de imagem confocal de disco giratório	Tecnologia Andor	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x óleo de silicone e 20x objetivas